Cell Host & Microbe | 深圳先進(jìn)院發(fā)現(xiàn)腸道噬菌體隱藏“免疫開關(guān)”——全新抗CRISPR蛋白家族
在我們每個(gè)人的腸道里,數(shù)萬億細(xì)菌與它們的“天敵”——噬菌體,正上演著一場持續(xù)億萬年的“軍備競賽”。CRISPR-Cas系統(tǒng)被譽(yù)為細(xì)菌的“免疫系統(tǒng)”,能精準(zhǔn)識(shí)別并切割入侵噬菌體的DNA。然而,噬菌體為了生存,進(jìn)化出了“抗CRISPR蛋白”(Acr),能夠“蒙蔽”或“關(guān)閉”細(xì)菌的CRISPR防御。這一攻防機(jī)制不僅是微生物世界的“軍備競賽”,也為我們提供了調(diào)控基因編輯工具的天然“開關(guān)”。但迄今為止,人類腸道作為微生物最密集、互作最復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)之一,其噬菌體所攜帶的Acr卻鮮少被系統(tǒng)研究。
近日,中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院定量合成生物學(xué)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、合成微生物組學(xué)研究中心馬迎飛團(tuán)隊(duì)成功從人類腸道噬菌體中,發(fā)現(xiàn)了一大批能夠抑制II型CRISPR系統(tǒng)的Acr,并揭示了一類全新的、結(jié)構(gòu)高度相似卻機(jī)制多樣的抗CRISPR蛋白家族——GutAcraca。相關(guān)研究成果發(fā)表于國際權(quán)威期刊Cell Host & Microbe,為理解腸道微生物互作機(jī)制以及開發(fā)新型基因編輯調(diào)控工具提供了新的視角。
II型CRISPR系統(tǒng)在腸道中占主導(dǎo)地位
在深入挖掘腸道噬菌體的抗CRISPR蛋白之前,研究團(tuán)隊(duì)首先對腸道細(xì)菌的“防御武器庫”進(jìn)行了全面普查。通過對人類腸道菌數(shù)據(jù)庫(UHGG)中近28.7萬個(gè)細(xì)菌基因組的系統(tǒng)分析,一個(gè)此前被低估的現(xiàn)象浮出水面:在人類腸道中,II型CRISPR系統(tǒng)(以Cas9蛋白為核心)占據(jù)了絕對的主導(dǎo)地位,占所有已識(shí)別CRISPR系統(tǒng)的47%。這一比例遠(yuǎn)超傳統(tǒng)認(rèn)知中在其它環(huán)境中更為普遍存在的I型系統(tǒng)。研究還發(fā)現(xiàn),其中相當(dāng)一部分的CRISPR RNA(crRNA)能夠精準(zhǔn)匹配到腸道病毒組的噬菌體序列。這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)研究提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ):既然腸道細(xì)菌普遍裝備了強(qiáng)大的II型CRISPR免疫系統(tǒng),那么作為其宿主的噬菌體,必然進(jìn)化出了同樣多樣且高效的抑制策略來突破這道防線。
腸道噬菌體是Acr的“寶庫”
基于上述發(fā)現(xiàn),研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一套整合大規(guī)模生物信息學(xué)分析與高通量功能篩選的實(shí)驗(yàn)體系,旨在系統(tǒng)性地“捕獲”腸道噬菌體編碼的Acr。他們首先利用CRISPR間隔區(qū)與病毒序列的匹配信息,鎖定了那些正與細(xì)菌進(jìn)行激烈攻防的噬菌體。隨后,結(jié)合“guilt by association”等策略,從33,242個(gè)腸道病毒基因組中篩選出13,493個(gè)候選基因。
為了高效驗(yàn)證這些海量候選基因的功能,團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了包含3,411個(gè)基因的高通量文庫,并將其逐一導(dǎo)入攜帶六種不同II型Cas9(SpyCas9, SaCas9, St1Cas9, St3Cas9, FnCas9, NmCas9)的大腸桿菌報(bào)告菌株中進(jìn)行功能篩選。通過多輪競爭性培養(yǎng)和深度測序,最終鑒定出651個(gè)能夠幫助細(xì)菌在CRISPR免疫壓力下存活的陽性Acr候選蛋白。研究團(tuán)隊(duì)從中隨機(jī)選取了36個(gè)代表性候選者,通過噬菌斑形成實(shí)驗(yàn),證實(shí)了它們確實(shí)能保護(hù)噬菌體免受CRISPR系統(tǒng)的攻擊,抑制活性得到充分驗(yàn)證(圖2)。這一結(jié)果強(qiáng)有力地證明,人類腸道是此前未被充分探索的Acr蛋白天然“寶庫”,其多樣性遠(yuǎn)超想象。
結(jié)構(gòu)相似但功能各異的GutAcraca家族
在對這651個(gè)陽性Acr進(jìn)行深入分析時(shí),一個(gè)引人注目的現(xiàn)象出現(xiàn)了。通過AlphaFold2結(jié)構(gòu)預(yù)測和TM-score結(jié)構(gòu)相似性比對,研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)一個(gè)由213個(gè)成員組成的巨大蛋白簇,這些蛋白盡管在氨基酸序列上差異巨大,卻驚人地折疊出高度相似的三維結(jié)構(gòu)(圖3)。
這一發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了領(lǐng)域內(nèi)關(guān)于Acr蛋白“極端多樣”的固有認(rèn)知。研究人員將這個(gè)結(jié)構(gòu)匯聚的蛋白家族命名為GutAcraca。通過對其中10個(gè)代表性成員的深入研究發(fā)現(xiàn),它們不僅能夠抑制多種Cas9同源物,展現(xiàn)出廣泛的抑制譜,而且具備“雙重功能”:既能像“斷路器”一樣抑制CRISPR系統(tǒng),又能作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,與其自身的啟動(dòng)子結(jié)合,實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的自我表達(dá)調(diào)控(圖3)。這種精巧的調(diào)控機(jī)制可能有助于噬菌體在整合到細(xì)菌基因組后,避免因過度表達(dá)Acr而造成不必要的代謝負(fù)擔(dān)或毒性,體現(xiàn)了噬菌體對腸道生態(tài)的精細(xì)適應(yīng)。
GutAcraca家族廣泛存在于腸道微生物群落中
GutAcraca家族并非孤立存在。為深入理解其生態(tài)學(xué)意義,研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步將分析拓展至更廣泛的腸道微生物群落。利用Foldseek結(jié)構(gòu)搜索工具,他們發(fā)現(xiàn)GutAcraca的結(jié)構(gòu)類似物廣泛分布于高達(dá)26%的腸道微生物物種中,主要存在于溶原性噬菌體基因組上,遍及厚壁菌門、變形菌門、放線菌門等主要細(xì)菌類群。尤為值得注意的是,超過82%攜帶GutAcraca基因的噬菌體被預(yù)測為“溫和噬菌體”,這類噬菌體常將自身DNA整合進(jìn)細(xì)菌基因組形成原噬菌體,與宿主長期共存(圖4)。這一發(fā)現(xiàn)提示,GutAcraca可能在噬菌體進(jìn)入溶原狀態(tài)時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用:通過抑制細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)的活性,保護(hù)自身DNA免遭宿主“自我免疫”攻擊,從而成為溫和噬菌體在復(fù)雜腸道環(huán)境中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定存活與長期演化的重要適應(yīng)策略。
新發(fā)現(xiàn)的抗CRISPR蛋白除具備上述功能特征外,還展現(xiàn)出若干獨(dú)特的優(yōu)勢,為其應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。首先,GutAcraca家族中超過72%的成員小于80個(gè)氨基酸。受此啟發(fā),團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)出僅含28個(gè)氨基酸的超短肽段仍具抑制活性,為目前已知最小的抗CRISPR元件;其次,AcrIIB-1則是對FnCas9抑制活性最強(qiáng)的Acr(圖5)。這些特征使其可作為基因編輯的“精準(zhǔn)開關(guān)”,實(shí)現(xiàn)對CRISPR系統(tǒng)的按需調(diào)控,從而有效降低脫靶效應(yīng)、提升基因治療安全性。
腸道噬菌體不僅是細(xì)菌的捕食者,更是自然界進(jìn)化的“創(chuàng)新工廠”。這項(xiàng)研究揭示了腸道噬菌體在長期進(jìn)化中形成的“智慧”,也為人類利用這些天然分子調(diào)控工程細(xì)胞、構(gòu)建合成細(xì)胞提供了全新思路。未來,隨著更多功能性Acr蛋白的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用,我們有望在基因治療、合成生物學(xué)、腸道菌群調(diào)控等領(lǐng)域迎來新一輪突破。
中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院助理研究員袁盛建、博士生朱衡及已出站博士后于夢浩為該論文共同第一作者。中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院定量合成生物學(xué)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、微生物組學(xué)研究中心馬迎飛研究員為該論文通訊作者。聯(lián)培博士生賈匯真、研究實(shí)習(xí)員彭仕文為參與作者,對本項(xiàng)工作做出重要貢獻(xiàn)。本項(xiàng)工作得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、深圳醫(yī)學(xué)科學(xué)院、深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院等項(xiàng)目的大力支持。

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圖1. CRISRP系統(tǒng)在腸道菌中的分布

圖2.?腸道噬菌體Acr的高通量挖掘和功能鑒定

圖3.?腸道噬菌體結(jié)構(gòu)相似的GutAcraca家族功能鑒定

圖4. GutAcraca家族在腸道菌群中的分布

圖5.?合成最小功能性Acr
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