JACS | 深圳先進院合作實現(xiàn)細菌二萜合酶的系統(tǒng)挖掘與結(jié)構(gòu)導向功能互換
萜類化合物是一類兼具重要經(jīng)濟價值和生物學功能的天然產(chǎn)物,其中二萜類化合物以其復雜的環(huán)化反應和顯著的生物活性而聞名,植物激素赤霉素、抗癌藥物紫杉醇均為其典型代表。過去幾十年,研究人員主要從植物和真菌中尋找新穎萜類化合物靈感,而近年來,細菌作為極具潛力卻尚未被充分挖掘的萜類生物合成基因?qū)殠?,正逐漸進入科學家的視野。然而,如何從數(shù)以萬計的候選基因中精準篩選出具有活性的萜類合酶,并理解其催化機制,是制約該領(lǐng)域核心瓶頸。
3月16日,中國科學院深圳先進技術(shù)研究院定量合成生物學全國重點實驗室、合成生物學研究所卞光凱團隊聯(lián)合華中農(nóng)業(yè)大學徐娟課題組和波恩大學Jeroen S. Dickschat課題組,在國際期刊Journal of the American Chemical Society上發(fā)表了題為"Systematic Discovery of Bacterial Diterpene Synthases and Structure-Guided Functional Interconversion of ShHS and CbCS"的最新研究成果。該研究通過系統(tǒng)挖掘細菌二萜合酶,顯著拓展了細菌二萜天然產(chǎn)物的化學空間,并揭示了活性中心微環(huán)境對產(chǎn)物骨架分化的決定作用。
在本研究中,研究團隊首先構(gòu)建了基于大規(guī)?;蚪M挖掘與工程酵母異源表達相結(jié)合的高通量篩選體系,對313個候選的細菌I型二萜合酶進行了高通量功能篩選。通過一系列篩選,團隊成功鑒定出16個具有二萜活性的萜類合酶(系列單萜、倍半萜和二倍半萜合酶功能驗證仍在進行中),并表征了10種新二萜化合物,其中包含5種全新碳骨架(圖1 B)。這一發(fā)現(xiàn)大幅擴展了細菌二萜類化合物的結(jié)構(gòu)多樣性和化學空間。
在此基礎(chǔ)上,研究人員進一步聚焦來源于Streptomyces hundungensis的二萜合酶ShHS。通過密度泛函理論計算與精確同位素標記實驗相結(jié)合,系統(tǒng)解析了該酶催化GGPP環(huán)化生成hundungol A及系列副產(chǎn)物的完整反應機制。研究表明,該反應首先通過GGPP異構(gòu)化生成GLPP,為后續(xù)關(guān)鍵的1,11-環(huán)化反應奠定構(gòu)象基礎(chǔ);隨后經(jīng)連續(xù)環(huán)化、氫遷移和甲基遷移過程,形成關(guān)鍵碳正離子中間體H。在后續(xù)反應階段,不同的環(huán)化路徑和骨架重排決定了最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分支,其中包括一次罕見的1,5-氫遷移步驟。此外,研究還發(fā)現(xiàn)CbCS的產(chǎn)物2雖與上述機制具有相同的早期反應步驟,但在中間體H處直接被水分子淬滅。
一個關(guān)鍵問題隨之出現(xiàn):是什么決定了CbCS和ShHS兩個酶在分支點H之后的反應方向?為了回答這一問題,研究人員成功解析了CbCS的晶體結(jié)構(gòu),同時借助AlphaFold3完成了ShHS的結(jié)構(gòu)預測,并將關(guān)鍵中間體H分別對接至兩個酶的活性中心開展比對分析。結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示,中間體H周圍共有17個潛在參與催化的氨基酸殘基,其中8個在兩種酶之間存在差異。通過定點突變實驗,研究人員成功實現(xiàn)了二者的功能互換:在ShHS中引入E193T和L196Y突變,可使其生成CbCS的主要產(chǎn)物;而在CbCS中引入相應的反向突變T194E和Y197L,則能產(chǎn)生ShHS的特征產(chǎn)物。此外,位于活性中心附近的關(guān)鍵位點N76/N81對反應路徑同樣具有重要調(diào)控作用。研究團隊進一步利用這些突變體,分離鑒定出hundungol C、hundungol D、chloroflexotol B和hundungene C等多種新型二萜化合物,并通過同位素標記實驗,驗證了這些化合物具有共同的早期環(huán)化過程,以及后期的1,5-氫遷移機制。
在論文評審過程中,國際同行專家對該研究給予了高度評價。審稿人指出,在當前萜類合酶大規(guī)模挖掘研究不斷涌現(xiàn)的背景下,該工作不僅是對新酶和新產(chǎn)物的羅列,更重要的是揭示了決定萜類骨架形成的結(jié)構(gòu)與機理??傮w而言,該研究通過整合基因組挖掘、合成生物學、結(jié)構(gòu)生物學與計算化學等多學科方法,不僅系統(tǒng)拓展了細菌二萜天然產(chǎn)物的化學空間,還揭示了萜類合酶如何通過活性中心精細調(diào)控碳正離子級聯(lián)重排,并實現(xiàn)不同產(chǎn)物骨架之間的可設(shè)計轉(zhuǎn)換,為理解萜類天然產(chǎn)物多樣性的分子基礎(chǔ)提供了關(guān)鍵線索,也為基于理性設(shè)計的天然產(chǎn)物生物合成、新型萜類分子定向創(chuàng)制提供了重要的理論與技術(shù)支撐。
中國科學院深圳先進院定量合成生物學全國重點實驗室、合成生物學研究所卞光凱研究員、華中農(nóng)業(yè)大學徐娟教授和波恩大學Jeroen S. Dickschat教授為本文共同通訊作者;中國科學院深圳先進技術(shù)研究院/華中農(nóng)業(yè)大學聯(lián)合培養(yǎng)博士生胡哲輝和波恩大學博士后Zhiyong Yin為本文共同第一作者。中國科學院深圳先進技術(shù)研究院為第一完成單位??坡〈髮WBernd Goldfuss教授、南方醫(yī)科大學羅奇副教授為研究提供重要支持。感謝深圳合成生物研究重大科技基礎(chǔ)設(shè)施在自動化萜類合酶挖掘和功能表征方面提供的支持。本研究得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、廣東省杰出青年基金、深圳市重點項目以及深圳合成生物學創(chuàng)新研究院等項目的支持。
卞光凱課題組簡介
卞光凱,中國科學院深圳先進技術(shù)研究院合成生物學研究所,研究員,博士生導師。課題組聚焦于天然產(chǎn)物生物合成與高效生物制造,真菌生物材料的理論及應用研究。近5年在Nature,Nat. Catal.,JACS,Angew. Chem,Adv. Mater.,Nat. Commun.,PNAS等期刊上發(fā)表一作和通訊文章十余篇。主持國家自然科學基金面上項目、深圳市自然科學基金基礎(chǔ)研究重點項目、科技部重點研發(fā)計劃等科研項目等多項經(jīng)費。(實驗室主頁: http://isynbio.siat.ac.cn/BianLab/)。

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圖1.?細菌中形成的二萜骨架的多樣性

圖2.?細菌二萜合酶的基因組挖掘和功能表征

圖3. ShHS和CbCS催化GGPP環(huán)化生成1、2和11-17的機制

圖4. ShHS和CbCS變體的功能相互轉(zhuǎn)化分析
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