JACS | 深圳先進(jìn)院合作實(shí)現(xiàn)細(xì)菌二萜合酶的系統(tǒng)挖掘與結(jié)構(gòu)導(dǎo)向功能互換
萜類(lèi)化合物是一類(lèi)兼具重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生物學(xué)功能的天然產(chǎn)物,其中二萜類(lèi)化合物以其復(fù)雜的環(huán)化反應(yīng)和顯著的生物活性而聞名,植物激素赤霉素、抗癌藥物紫杉醇均為其典型代表。過(guò)去幾十年,研究人員主要從植物和真菌中尋找新穎萜類(lèi)化合物靈感,而近年來(lái),細(xì)菌作為極具潛力卻尚未被充分挖掘的萜類(lèi)生物合成基因?qū)殠?kù),正逐漸進(jìn)入科學(xué)家的視野。然而,如何從數(shù)以萬(wàn)計(jì)的候選基因中精準(zhǔn)篩選出具有活性的萜類(lèi)合酶,并理解其催化機(jī)制,是制約該領(lǐng)域核心瓶頸。
3月16日,中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院定量合成生物學(xué)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、合成生物學(xué)研究所卞光凱團(tuán)隊(duì)聯(lián)合華中農(nóng)業(yè)大學(xué)徐娟課題組和波恩大學(xué)Jeroen S. Dickschat課題組,在國(guó)際期刊Journal of the American Chemical Society上發(fā)表了題為"Systematic Discovery of Bacterial Diterpene Synthases and Structure-Guided Functional Interconversion of ShHS and CbCS"的最新研究成果。該研究通過(guò)系統(tǒng)挖掘細(xì)菌二萜合酶,顯著拓展了細(xì)菌二萜天然產(chǎn)物的化學(xué)空間,并揭示了活性中心微環(huán)境對(duì)產(chǎn)物骨架分化的決定作用。
在本研究中,研究團(tuán)隊(duì)首先構(gòu)建了基于大規(guī)模基因組挖掘與工程酵母異源表達(dá)相結(jié)合的高通量篩選體系,對(duì)313個(gè)候選的細(xì)菌I型二萜合酶進(jìn)行了高通量功能篩選。通過(guò)一系列篩選,團(tuán)隊(duì)成功鑒定出16個(gè)具有二萜活性的萜類(lèi)合酶(系列單萜、倍半萜和二倍半萜合酶功能驗(yàn)證仍在進(jìn)行中),并表征了10種新二萜化合物,其中包含5種全新碳骨架(圖1 B)。這一發(fā)現(xiàn)大幅擴(kuò)展了細(xì)菌二萜類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)多樣性和化學(xué)空間。
在此基礎(chǔ)上,研究人員進(jìn)一步聚焦來(lái)源于Streptomyces hundungensis的二萜合酶ShHS。通過(guò)密度泛函理論計(jì)算與精確同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)相結(jié)合,系統(tǒng)解析了該酶催化GGPP環(huán)化生成hundungol A及系列副產(chǎn)物的完整反應(yīng)機(jī)制。研究表明,該反應(yīng)首先通過(guò)GGPP異構(gòu)化生成GLPP,為后續(xù)關(guān)鍵的1,11-環(huán)化反應(yīng)奠定構(gòu)象基礎(chǔ);隨后經(jīng)連續(xù)環(huán)化、氫遷移和甲基遷移過(guò)程,形成關(guān)鍵碳正離子中間體H。在后續(xù)反應(yīng)階段,不同的環(huán)化路徑和骨架重排決定了最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分支,其中包括一次罕見(jiàn)的1,5-氫遷移步驟。此外,研究還發(fā)現(xiàn)CbCS的產(chǎn)物2雖與上述機(jī)制具有相同的早期反應(yīng)步驟,但在中間體H處直接被水分子淬滅。
一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題隨之出現(xiàn):是什么決定了CbCS和ShHS兩個(gè)酶在分支點(diǎn)H之后的反應(yīng)方向?為了回答這一問(wèn)題,研究人員成功解析了CbCS的晶體結(jié)構(gòu),同時(shí)借助AlphaFold3完成了ShHS的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),并將關(guān)鍵中間體H分別對(duì)接至兩個(gè)酶的活性中心開(kāi)展比對(duì)分析。結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示,中間體H周?chē)灿?7個(gè)潛在參與催化的氨基酸殘基,其中8個(gè)在兩種酶之間存在差異。通過(guò)定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn),研究人員成功實(shí)現(xiàn)了二者的功能互換:在ShHS中引入E193T和L196Y突變,可使其生成CbCS的主要產(chǎn)物;而在CbCS中引入相應(yīng)的反向突變T194E和Y197L,則能產(chǎn)生ShHS的特征產(chǎn)物。此外,位于活性中心附近的關(guān)鍵位點(diǎn)N76/N81對(duì)反應(yīng)路徑同樣具有重要調(diào)控作用。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步利用這些突變體,分離鑒定出hundungol C、hundungol D、chloroflexotol B和hundungene C等多種新型二萜化合物,并通過(guò)同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了這些化合物具有共同的早期環(huán)化過(guò)程,以及后期的1,5-氫遷移機(jī)制。
在論文評(píng)審過(guò)程中,國(guó)際同行專(zhuān)家對(duì)該研究給予了高度評(píng)價(jià)。審稿人指出,在當(dāng)前萜類(lèi)合酶大規(guī)模挖掘研究不斷涌現(xiàn)的背景下,該工作不僅是對(duì)新酶和新產(chǎn)物的羅列,更重要的是揭示了決定萜類(lèi)骨架形成的結(jié)構(gòu)與機(jī)理??傮w而言,該研究通過(guò)整合基因組挖掘、合成生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)與計(jì)算化學(xué)等多學(xué)科方法,不僅系統(tǒng)拓展了細(xì)菌二萜天然產(chǎn)物的化學(xué)空間,還揭示了萜類(lèi)合酶如何通過(guò)活性中心精細(xì)調(diào)控碳正離子級(jí)聯(lián)重排,并實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)物骨架之間的可設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)換,為理解萜類(lèi)天然產(chǎn)物多樣性的分子基礎(chǔ)提供了關(guān)鍵線索,也為基于理性設(shè)計(jì)的天然產(chǎn)物生物合成、新型萜類(lèi)分子定向創(chuàng)制提供了重要的理論與技術(shù)支撐。
中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)院定量合成生物學(xué)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、合成生物學(xué)研究所卞光凱研究員、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)徐娟教授和波恩大學(xué)Jeroen S. Dickschat教授為本文共同通訊作者;中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)博士生胡哲輝和波恩大學(xué)博士后Zhiyong Yin為本文共同第一作者。中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院為第一完成單位??坡〈髮W(xué)Bernd Goldfuss教授、南方醫(yī)科大學(xué)羅奇副教授為研究提供重要支持。感謝深圳合成生物研究重大科技基礎(chǔ)設(shè)施在自動(dòng)化萜類(lèi)合酶挖掘和功能表征方面提供的支持。本研究得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、廣東省杰出青年基金、深圳市重點(diǎn)項(xiàng)目以及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院等項(xiàng)目的支持。
卞光凱課題組簡(jiǎn)介
卞光凱,中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所,研究員,博士生導(dǎo)師。課題組聚焦于天然產(chǎn)物生物合成與高效生物制造,真菌生物材料的理論及應(yīng)用研究。近5年在Nature,Nat. Catal.,JACS,Angew. Chem,Adv. Mater.,Nat. Commun.,PNAS等期刊上發(fā)表一作和通訊文章十余篇。主持國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目、深圳市自然科學(xué)基金基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目、科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等科研項(xiàng)目等多項(xiàng)經(jīng)費(fèi)。(實(shí)驗(yàn)室主頁(yè): http://isynbio.siat.ac.cn/BianLab/)。

文章上線截圖

圖1.?細(xì)菌中形成的二萜骨架的多樣性

圖2.?細(xì)菌二萜合酶的基因組挖掘和功能表征

圖3. ShHS和CbCS催化GGPP環(huán)化生成1、2和11-17的機(jī)制

圖4. ShHS和CbCS變體的功能相互轉(zhuǎn)化分析
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