Cell Reports Methods | 深圳先進(jìn)院開(kāi)發(fā)微生物組自動(dòng)化空間成像平臺(tái)SEER-Map
微生物群落的空間結(jié)構(gòu)深刻影響著物種間的相互作用及宿主的健康狀態(tài),是解析微生態(tài)功能的關(guān)鍵。然而,主流高通量測(cè)序技術(shù)往往無(wú)法保留微生物的原位空間信息;熒光原位雜交(FISH)技術(shù)雖能在單細(xì)胞分辨率下實(shí)現(xiàn)微生物的原位可視化分析,但受限于傳統(tǒng)光學(xué)成像的性能瓶頸與繁瑣的人工操作流程,其在高復(fù)雜度物種標(biāo)記、高通量實(shí)驗(yàn)、多重檢測(cè)及規(guī)?;瘧?yīng)用方面面臨顯著挑戰(zhàn)。因此,突破人工操作依賴,在單細(xì)胞分辨率下對(duì)復(fù)雜微生物群落實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化的原位空間全景成像與分析,是當(dāng)前空間微生物組學(xué)領(lǐng)域亟待突破的關(guān)鍵問(wèn)題。
2026年4月8日,中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院定量合成生物學(xué)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、合成生物學(xué)研究所戴磊課題組在Cell Press旗下期刊Cell Reports Methods上發(fā)表研究論文《Spatial mapping of microbial communities by an integrated automation platform of sequential FISH》。團(tuán)隊(duì)在前期開(kāi)發(fā)的SEER-FISH技術(shù)基礎(chǔ)上,進(jìn)一步構(gòu)建了序貫容錯(cuò)熒光原位雜交自動(dòng)化空間成像平臺(tái)SEER-Map。該平臺(tái)可在無(wú)人值守條件下連續(xù)完成40輪雜交成像,同時(shí)依托優(yōu)化的樣品前處理方案,大幅降低了試劑成本,為系統(tǒng)解析微生物群落在微米尺度的空間生物地理分布和物種互作關(guān)系提供了強(qiáng)有力的技術(shù)工具。
01 從SEER-FISH到SEER-Map:序貫FISH技術(shù)的全自動(dòng)化
戴磊課題組此前開(kāi)發(fā)的基于容錯(cuò)編碼的序貫熒光原位雜交(SEER-FISH)技術(shù),已成功突破了傳統(tǒng)光學(xué)成像在熒光通道數(shù)量上的限制(成果回顧:Nature Communications | SEER-FISH成像技術(shù):解析微生物組空間結(jié)構(gòu)的新利器)。然而,該技術(shù)依賴手動(dòng)操作完成每一輪的雜交-成像-解離循環(huán),在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨標(biāo)準(zhǔn)化、復(fù)用性與規(guī)?;茝V的挑戰(zhàn)。
針對(duì)這一核心瓶頸,研究團(tuán)隊(duì)搭建了一套集流體控制與顯微鏡成像于一體的自動(dòng)化平臺(tái)(圖1)。硬件方面,該系統(tǒng)配備數(shù)十個(gè)獨(dú)立可控的試劑端口,通過(guò)蠕動(dòng)泵與流體歧管,將雜交緩沖液、洗滌液及探針解離試劑精準(zhǔn)輸送至樣本腔室。軟件層面,流體控制軟件與顯微鏡成像系統(tǒng)協(xié)同運(yùn)作,通過(guò)程序化編程精準(zhǔn)調(diào)控多通道試劑的選擇、流速與孵育時(shí)間,并與顯微鏡的圖像采集軟件聯(lián)動(dòng),實(shí)現(xiàn)從樣本預(yù)處理到多輪序貫雜交成像的自動(dòng)運(yùn)行。
該系統(tǒng)的穩(wěn)定性在實(shí)驗(yàn)中得到了充分驗(yàn)證。在累計(jì)時(shí)長(zhǎng)約15小時(shí)的連續(xù)40輪自動(dòng)化原位雜交實(shí)驗(yàn)中,定量分析結(jié)果顯示,F(xiàn)ITC、Cy3、Cy5等熒光通道的雜交信號(hào)均保持高度穩(wěn)定。每輪解離步驟后的背景殘留信號(hào)均被控制在5%以下,充分驗(yàn)證了該系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性,為大規(guī)??臻g微生物組學(xué)研究提供了堅(jiān)實(shí)的硬件支撐。
02 優(yōu)化樣品前處理方法:降本增效,檢測(cè)效率顯著提高
在熒光原位雜交中,樣品前處理的質(zhì)量直接影響了微生物的檢測(cè)效率。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)系統(tǒng)梯度實(shí)驗(yàn),評(píng)估了溶菌酶處理與雜交反應(yīng)中探針使用濃度的協(xié)同作用。結(jié)果表明,在復(fù)雜的植物根際樣品中,采用溶菌酶預(yù)處理并結(jié)合12 nM低濃度探針的優(yōu)化方案,細(xì)菌細(xì)胞檢出量較未處理組提升111%。
探針濃度由常規(guī)200 nM大幅降至12 nM后,在顯著降低試劑成本的同時(shí),實(shí)現(xiàn)了更優(yōu)異的單細(xì)胞圖像分割效果。低濃度探針在保證有效信號(hào)強(qiáng)度的前提下,可有效避免信號(hào)過(guò)飽和與擴(kuò)散問(wèn)題,顯著提升密集細(xì)菌簇的單細(xì)胞圖像分割精度。這一優(yōu)化使SEER-Map在大規(guī)模應(yīng)用中更具經(jīng)濟(jì)性與可行性。
03 解析復(fù)雜微生物群落在宿主環(huán)境下的空間圖譜
為驗(yàn)證SEER-Map的應(yīng)用能力,研究團(tuán)隊(duì)對(duì)由30株菌株組成的合成微生物群落(SynCom30)在擬南芥根系的定殖情況進(jìn)行了全面的空間解析(圖3)。實(shí)驗(yàn)比較了兩種擬南芥基因型:野生型(Col-0)和香豆素合成缺陷突變體f6'h1。F6'H1基因是擬南芥根系分泌香豆素的關(guān)鍵基因,這類代謝物在促進(jìn)鐵吸收和選擇性調(diào)控根際微生物組成方面發(fā)揮雙重作用。實(shí)驗(yàn)旨在揭示宿主的化學(xué)信號(hào)對(duì)微生物群落空間結(jié)構(gòu)的精細(xì)調(diào)控。
研究團(tuán)隊(duì)采用系統(tǒng)化的探針設(shè)計(jì)策略,基于全長(zhǎng)16S rRNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育聚類、共識(shí)序列生成和特異性探針篩選,并構(gòu)建了R8HD4(8輪、漢明距離4)的糾錯(cuò)編碼方案,確保了多輪雜交過(guò)程中物種的精準(zhǔn)識(shí)別與信號(hào)解碼。借助SEER-Map,研究團(tuán)隊(duì)在距根尖約4 mm的區(qū)域內(nèi)繪制了群落內(nèi)28種定殖細(xì)菌的高分辨空間分布圖譜,展現(xiàn)出高檢測(cè)分辨率與靈敏度。通過(guò)空間生態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),根表定殖的微生物并非隨機(jī)分布。線性偶極分析算法顯示,其在約20 μm范圍內(nèi)呈現(xiàn)顯著的非隨機(jī)聚集模式,形成了具有結(jié)構(gòu)化特征的微小聚集體。在更微觀的10 μm尺度下,不同分類群之間表現(xiàn)出復(fù)雜的正向與負(fù)向空間共現(xiàn)關(guān)系。需要指出的是,微生物這種微尺度的空間關(guān)聯(lián),不僅暗示其可能存在營(yíng)養(yǎng)互養(yǎng)、競(jìng)爭(zhēng)抑制等直接生態(tài)互作關(guān)系,也反映出微生物受宿主環(huán)境驅(qū)動(dòng)形成的共性或差異化生態(tài)位偏好。此外,研究進(jìn)一步揭示了宿主基因型對(duì)定殖偏好的精細(xì)調(diào)控:盡管農(nóng)桿菌(Agrobacterium sp.)在不同基因型中均傾向于定殖在根分化區(qū),但溶桿菌(Lysobacter sp.)在f6'h1突變體中表現(xiàn)出根尖富集趨向。這些空間分布差異顯示,宿主分泌的香豆素類代謝物正在重塑根際微生物的空間分布格局。
04 總結(jié)與展望
SEER-Map平臺(tái)的構(gòu)建,依托自動(dòng)化的流體-成像集成系統(tǒng)與優(yōu)化的樣品前處理方案,成功突破了原有序貫熒光原位雜交技術(shù)在檢測(cè)通量、實(shí)驗(yàn)成本及標(biāo)準(zhǔn)化推廣方面的瓶頸。研究團(tuán)隊(duì)在擬南芥葉片與水稻根系等多種典型植物-微生物互作界面的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),充分展現(xiàn)了該平臺(tái)的廣譜適用性與廣闊應(yīng)用前景。
中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院定量合成生物學(xué)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、合成生物學(xué)研究所戴磊研究員為本文通訊作者,中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所博士生曹朝輝為本文第一作者,深圳先進(jìn)院為第一完成單位。本研究獲深圳醫(yī)學(xué)研究專項(xiàng)和國(guó)家自然科學(xué)基金的資助,并依托深圳合成生物研究重大科技基礎(chǔ)設(shè)施順利完成。

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圖1. SEER-Map自動(dòng)化平臺(tái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健、高擴(kuò)展性的微生物群落空間成像

圖2.?樣品前處理優(yōu)化顯著提升細(xì)菌檢測(cè)效率

圖3.?擬南芥根系定殖微生物群落的高分辨率空間解析
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