Bioresource Technology | 合成生物學(xué)與環(huán)境工程相結(jié)合開(kāi)創(chuàng)藻類(lèi)處理畜牧業(yè)廢水新紀(jì)元
畜牧業(yè)每年將生產(chǎn)240億噸廢水,廢水的排放導(dǎo)致水資源的嚴(yán)重富營(yíng)養(yǎng)化。此外,集中飼養(yǎng)動(dòng)物的大型農(nóng)場(chǎng)需要大量使用激素和抗生素,對(duì)周?chē)牡鷳B(tài)系統(tǒng)等產(chǎn)生負(fù)面影響。比如,畜牧業(yè)廢水中的厭氧消化后的出水的主要特點(diǎn)包括1)氨氮濃度高(1000-2000 mg/L),2)抗生素種類(lèi)繁多,且3)碳氮比(C/N<1)往往低于傳統(tǒng)活性污泥所需的營(yíng)養(yǎng)比例(C/N >5)。因此,厭氧消化后的水不利于后續(xù)活性污泥法的反硝化過(guò)程的進(jìn)行,從而導(dǎo)致總氮濃度偏高。另一方面,目前研究藻類(lèi)處理法存在的問(wèn)題包括:1)無(wú)法適應(yīng)高氨氮以及多類(lèi)型抗生素所帶來(lái)的毒性問(wèn)題,2)藻類(lèi)的收集也是目前比較關(guān)注的問(wèn)題;3)其較長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期和廢水處理時(shí)間勢(shì)必會(huì)大大增加大規(guī)模連續(xù)式反應(yīng)系統(tǒng)的水利停留時(shí)間,從而影響整個(gè)水廠的建造和運(yùn)營(yíng)成本。
近日,由中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所的Howard H. Chou課題組,成都信息工程大學(xué)的張輝課題組以及美國(guó)克萊姆森大學(xué)的陳寰課題組在Bioresource Technology期刊發(fā)表重要研究成果"Two-stage continuous cultivation of microalgae overexpressing cytochrome P450 improves nitrogen and antibiotics removal from livestock and poultry wastewater"。
研究發(fā)現(xiàn),一種小球藻(Chlorella vulgaris)通過(guò)定向進(jìn)化可以適應(yīng)在含有高氨氮和低碳氮比的畜牧業(yè)厭氧消化廢水中生長(zhǎng)。并且本次研究采用了一種設(shè)計(jì)-建造-測(cè)試-學(xué)習(xí)(DBTL)相結(jié)合的研究模式優(yōu)化了利用該菌株來(lái)處理廢水的連續(xù)工藝,以實(shí)現(xiàn)加速氨氮的去除和縮短水利停留時(shí)間(HRT)。與此同時(shí),經(jīng)過(guò)改造的菌株還有效地去除了廢水中的多種抗生素。該研究通過(guò)生理、化學(xué)、代謝物、轉(zhuǎn)錄組和遺傳分析,闡明了小球藻在廢水中生存的耐受性、氨氮去除和抗生素降解的機(jī)制。最終研究表明,在小球藻中過(guò)表達(dá)新鑒定的P450酶可以改善氨氮、有機(jī)氮和抗生素的降解。
這項(xiàng)研究為開(kāi)發(fā)基于微藻的工藝以改善畜牧業(yè)中的氮和水循環(huán)提供了寶貴的見(jiàn)解。同時(shí),在合成生物學(xué)和環(huán)境工程層面,該研究也為后續(xù)優(yōu)化藻類(lèi)污水處理技術(shù)提供了新的思路和發(fā)展方向。

文章上線截圖
清潔的水源和食物是人類(lèi)健康和全球可持續(xù)發(fā)展相互關(guān)聯(lián)的重要資源。工業(yè)化養(yǎng)殖利用大量清潔水,同時(shí)產(chǎn)生大量廢水,對(duì)淡水供應(yīng)造成負(fù)擔(dān)。據(jù)估計(jì),畜牧業(yè)每年為了生產(chǎn) 560 億頭牲畜供消費(fèi)會(huì)產(chǎn)生 240 億噸廢水,預(yù)計(jì)到 2050 年消費(fèi)量將超過(guò) 1000 億頭牲畜 (Sepúlveda-Mu?oz et al., 2023)。為了滿足這種日益增長(zhǎng)的需求,人們建立了大規(guī)模的集中飼養(yǎng)農(nóng)場(chǎng),需要大量使用激素和抗生素 (Vaishnav et al., 2023)。然而,廢水往往在未進(jìn)行有效營(yíng)養(yǎng)管理的情況下排放,導(dǎo)致全球 64-97% 的富營(yíng)養(yǎng)化 (Silva-Gálvez et al., 2024)??股卦趶U水中的積累及向環(huán)境的釋放可能會(huì)對(duì)抗生素耐藥性產(chǎn)生潛在的不利影響,加劇與耐藥病原體相關(guān)的現(xiàn)有問(wèn)題 (Wang et al., 2021)。因此,畜牧業(yè)廢水管理不當(dāng)會(huì)對(duì)周?chē)牡鷳B(tài)系統(tǒng)以及人類(lèi)健康和安全產(chǎn)生負(fù)面影響。
傳統(tǒng)的畜牧業(yè)廢水處理過(guò)程采用兩步法。首先,利用厭氧消化來(lái)極大地降低化學(xué)需氧量 (COD)。然后,使用好氧活性污泥氧化去除剩余的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。厭氧消化步驟至關(guān)重要,因?yàn)楦?COD 會(huì)抑制污泥的生長(zhǎng) (Wang et al., 2016)。厭氧消化還有一個(gè)額外的好處,那就是以沼氣的形式創(chuàng)造綠色能源。在中國(guó),每年通過(guò)加工牲畜糞便生產(chǎn) 145 億立方米沼氣 (Ran et al., 2021)。然而,厭氧消化后殘留的總氮(TN)較高,尤其是氨氮可高達(dá) 1000-2000 mg/L,使得厭氧消化出水中的碳氮比(COD/TN)較低,污泥沒(méi)有足夠的碳源進(jìn)行生長(zhǎng),從而降低了第二步中活性污泥去除營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力 (Zhang et al., 2022)。基于微藻的處理工藝,其好處在于微藻獨(dú)特的生理和代謝途徑使得其可以通過(guò)固定 CO2合成有機(jī)碳源,從而生長(zhǎng)在低 COD/TN的污水環(huán)境中。然而,微藻對(duì)于高氨氮和復(fù)合型抗生素廢水的適應(yīng)能力較差,同時(shí)目前基于微藻的處理工藝需要較長(zhǎng)的水力停留時(shí)間 (HRT),約為 8-12 天 (de Mendon?a et al., 2018),這限制了它們?cè)谏虡I(yè)工藝中的廣泛應(yīng)用。為此,本研究旨在探索小球藻去除畜牧業(yè)厭氧廢水中的氮和抗生素的潛在機(jī)制。并通過(guò)設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)(DBTL)策略,將環(huán)境工程和合成生物學(xué)方法相結(jié)合,用以去除廢水中的氮和異類(lèi)污染物以及縮短水力停留時(shí)間。
定向進(jìn)化小球藻對(duì)畜牧業(yè)廢水的處理
利用定向進(jìn)化技術(shù),篩選到了新型小球藻(M5)能夠快速地去除廢水中的總氮(TN),氨氮(NH4-N)和總磷(TP)。在鴨場(chǎng)厭氧廢水中實(shí)現(xiàn)了 192 mg TN/L/d、177 mg NH4-N/L/d 和 2 mg TP/L/d 的去除率,在養(yǎng)豬場(chǎng)厭氧廢水中實(shí)現(xiàn)了 160 mg TN/L/d、125 mg NH4-N/L/d 和 6 mg TP/L/d 的去除率 (圖1a 和b)。與之前發(fā)表的研究相比,在TN含量高出 4 倍的情況下,M5對(duì)TN去除率仍舊高出 8 倍 (Wang et al., 2016)。同時(shí),發(fā)現(xiàn)M5可有效去除鴨場(chǎng)廢水中的強(qiáng)力霉素、磺胺甲氧噠嗪、環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶(圖 1c)。在豬場(chǎng)廢水中,也可有效去除磺胺甲氧噠嗪、磺胺二甲嘧啶、強(qiáng)力霉素、土霉素、磺胺間甲氧嘧啶、培氟沙星、金霉素和四環(huán)素(圖 1d)。




圖 1. 畜禽廢水的批量處理工藝。處理(a)鴨場(chǎng)和(b)豬場(chǎng)廢水時(shí)細(xì)胞密度、化學(xué)需氧量 (COD)、總氮(TN)、銨氮(NH4-N)、總有機(jī)氮(TON)和總磷(TP)濃度的變化。M5 處理后(c)鴨場(chǎng)和(d)豬場(chǎng)廢水中抗生素的去除率
連續(xù)反饋式處理系統(tǒng)的搭建
為了能夠讓 M5 投入商業(yè)應(yīng)用,并且與傳統(tǒng)的活性污泥法的水力停留時(shí)間相匹配(HRT=4-6天),我們利用了 DBTL 策略來(lái)建立了一套新型兩級(jí)連續(xù)反饋式處理系統(tǒng)(CFP)。經(jīng)過(guò)了長(zhǎng)達(dá)兩個(gè)月的觀察,CFP工藝在水力停留時(shí)間為4天的情況下實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的污染物降解率,其中在鴨場(chǎng)廢水中的去除率為 334 mg TN/L/d、306 mg NH4-N/L/d 和 4 mg TP/L/d,在豬場(chǎng)廢水中的去除率為 213 mg TN/L/d、213 mg NH4-N/L/d 和 10 mg TP/L/d。即使在將系統(tǒng)總工作體積減少 43% 后,使用CFP工藝的 NH4-N 去除率仍比搖瓶實(shí)驗(yàn)高出 70%。另一方面,在對(duì) CFP 系統(tǒng)中抗生素濃度的分析表明,林可霉素、恩諾沙星、磺胺甲氧噠嗪、螺旋霉素、磺胺嘧啶和泰樂(lè)菌素的去除效果均有所改善(圖 2f、g)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)了該套工藝已經(jīng)可以和傳統(tǒng)的活性污泥法的處理效率不相上下了,甚至在總氮的處理方面比污泥法更勝一籌。




圖 2. 連續(xù)反饋工藝處理畜牧業(yè)廢水。(a)連續(xù)反饋系統(tǒng)示意圖。處理(b、c)鴨場(chǎng)厭氧消化廢水(DFWD)和(d、e)養(yǎng)豬場(chǎng)厭氧消化廢水(PWD)后,I 和 II 階段的細(xì)胞密度、化學(xué)需氧量(COD)、總氮(TN)、銨氮(NH4-N)和總磷(TP)濃度。從(f)DFWD 和(g)PWD 中抗生素去除率
新型P450酶用于畜牧業(yè)廢水處理
為了進(jìn)一步探索 M5 降解廢水的潛在機(jī)理,我們通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序挖掘了高表達(dá)的 P450 酶,其中經(jīng)過(guò)分析和比對(duì),發(fā)現(xiàn)了一段完整的高表達(dá) P450 酶的基因(A23292)。為了驗(yàn)證這段基因的潛在功能,將其重新在未進(jìn)化的原始小球藻(M2)細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行了過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。研究表明 A23292 過(guò)表達(dá)的小球藻細(xì)胞(M2+N)足以耐受畜牧業(yè)廢水中的抑制化合物。經(jīng)過(guò)M2過(guò)表達(dá)密碼子優(yōu)化的 A23292 處理后(M2+CO),鴨場(chǎng)和豬場(chǎng)廢水中的氨氮去除率分別提高了 11 倍和 5 倍(圖 3a、b)。因此,氨氮去除率的提高可能是由于 A23292 從廢水中去除了生長(zhǎng)抑制化學(xué)物質(zhì),從而促進(jìn)了更高的細(xì)胞生長(zhǎng),從而加速了氨氮的去除。在 A23292 過(guò)表達(dá)后,鴨場(chǎng)和豬場(chǎng)廢水中實(shí)現(xiàn)的 NH4-N 去除率分別為 470 mg NH4-N/L/d 和 240 mg NH4-N/L/d。另一方面,M2 過(guò)表達(dá)密碼子優(yōu)化的 A23292 后,林可霉素、恩諾沙星和泰樂(lè)菌素的去除率分別提高了 60%、40% 和 130%(圖 3c)。這些增加表明A23292參與了這些抗生素的水解作用。
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圖 3. 細(xì)胞色素 P450 對(duì)畜牧業(yè)廢水的解毒測(cè)試。通過(guò) M2 與空載體對(duì)照(M2+EV)、M5、過(guò)表達(dá)天然 A23292 的 M2(M2+N)和過(guò)表達(dá)密碼子優(yōu)化的 A23292 的 M2(M2+CO),去除(a)鴨場(chǎng)和(b)豬場(chǎng)廢水中的化學(xué)需氧量(COD)、總氮(TN)、銨氮(NH4-N)、總有機(jī)氮(TON)和總磷(TP)。(c)在 BG-11 中,通過(guò)過(guò)表達(dá)密碼子優(yōu)化的 A2329 的 M2 抗生素(500 μg/L)去除率
本研究主要提供了兩種改進(jìn)基于藻類(lèi)的高氨氮畜牧業(yè)厭氧消化廢水的處理方法。一種方法是基于合成生物學(xué)改造,通過(guò)過(guò)表達(dá)密碼子優(yōu)化后的 P450 酶來(lái)增強(qiáng)對(duì)有毒物質(zhì)的解毒。另一種是基于 DBTL 策略,開(kāi)發(fā)通過(guò)細(xì)胞回流步驟來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞的毒性耐受性并保持細(xì)胞繁殖能力。這兩種方法已在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上得到驗(yàn)證,并且為以下學(xué)科領(lǐng)域和工程方面提供了一些新的思路和應(yīng)用:1)通過(guò)蛋白質(zhì)工程改進(jìn)小球藻 P450 酶的活性;2)分析結(jié)構(gòu)并探索 P450 酶在其他類(lèi)型廢水中的潛在功能;3)可以研究基于藻類(lèi)的 CFP 工藝與活性污泥工藝的結(jié)合進(jìn)一步去除 COD 和 TN。
中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院的博士后肖睿為文章的第一作者,正高級(jí)工程師Howard H. Chou為文章的通訊作者。本研究得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中國(guó)博士后科學(xué)基金以及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院的支持。
參考文獻(xiàn)
Ran, C., Zhou, X., Yao, C., Zhang, Y., Kang, W., Liu, X., Herbert, C., Xie, T. 2021. Swine digestate treatment by prior nitrogen-starved Chlorella vulgaris: The effect of over-compensation strategy on microalgal biomass production and nutrient removal. Science of The Total Environment, 768, 144462.
Sepúlveda-Mu?oz, C.A., de Godos, I., Mu?oz, R. 2023. Wastewater Treatment Using Photosynthetic Microorganisms. Symmetry, 15(2), 525.
Silva-Gálvez, A.L., López-Sánchez, A., Camargo-Valero, M.A., Prosenc, F., González-López, M.E., Gradilla-Hernández, M.S. 2024. Strategies for livestock wastewater treatment and optimised nutrient recovery using microalgal-based technologies. Journal of Environmental Management, 354, 120258.
Vaishnav, S., Saini, T., Chauhan, A., Gaur, G.K., Tiwari, R., Dutt, T., Tarafdar, A. 2023. Livestock and poultry farm wastewater treatment and its valorization for generating value-added products: Recent updates and way forward. Bioresource Technology, 382, 129170.
Wang, M., Yang, Y., Chen, Z., Chen, Y., Wen, Y., Chen, B. 2016. Removal of nutrients from undiluted anaerobically treated piggery wastewater by improved microalgae. Bioresource Technology, 222, 130-138.
Wang, X.-R., Lian, X.-L.,Su, T.-T., Long, T.-F.,Li, M.-Y., Feng, X.-Y., Sun, R.-Y., Cui, Z.-H., Tang, T., Xia, J. 2021. Duck wastes as a potential reservoir of novel antibiotic resistance genes. Science of The Total Environment, 771, 144828.
Zhang, W., Kong, T., Xing, W.,Li, R., Yang, T., Yao, N.,Lv, D. 2022. Links between carbon/nitrogen ratio, synergy and microbial characteristics of long-term semi-continuous anaerobic co-digestion of food waste, cattle manure and corn straw. Bioresource Technology, 343, 126094.
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