Bioresource Technology | 合成生物學(xué)與環(huán)境工程相結(jié)合開創(chuàng)藻類處理畜牧業(yè)廢水新紀(jì)元
畜牧業(yè)每年將生產(chǎn)240億噸廢水,廢水的排放導(dǎo)致水資源的嚴(yán)重富營養(yǎng)化。此外,集中飼養(yǎng)動(dòng)物的大型農(nóng)場需要大量使用激素和抗生素,對周圍的淡水生態(tài)系統(tǒng)等產(chǎn)生負(fù)面影響。比如,畜牧業(yè)廢水中的厭氧消化后的出水的主要特點(diǎn)包括1)氨氮濃度高(1000-2000 mg/L),2)抗生素種類繁多,且3)碳氮比(C/N<1)往往低于傳統(tǒng)活性污泥所需的營養(yǎng)比例(C/N >5)。因此,厭氧消化后的水不利于后續(xù)活性污泥法的反硝化過程的進(jìn)行,從而導(dǎo)致總氮濃度偏高。另一方面,目前研究藻類處理法存在的問題包括:1)無法適應(yīng)高氨氮以及多類型抗生素所帶來的毒性問題,2)藻類的收集也是目前比較關(guān)注的問題;3)其較長的生長周期和廢水處理時(shí)間勢必會(huì)大大增加大規(guī)模連續(xù)式反應(yīng)系統(tǒng)的水利停留時(shí)間,從而影響整個(gè)水廠的建造和運(yùn)營成本。
近日,由中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所的Howard H. Chou課題組,成都信息工程大學(xué)的張輝課題組以及美國克萊姆森大學(xué)的陳寰課題組在Bioresource Technology期刊發(fā)表重要研究成果"Two-stage continuous cultivation of microalgae overexpressing cytochrome P450 improves nitrogen and antibiotics removal from livestock and poultry wastewater"。
研究發(fā)現(xiàn),一種小球藻(Chlorella vulgaris)通過定向進(jìn)化可以適應(yīng)在含有高氨氮和低碳氮比的畜牧業(yè)厭氧消化廢水中生長。并且本次研究采用了一種設(shè)計(jì)-建造-測試-學(xué)習(xí)(DBTL)相結(jié)合的研究模式優(yōu)化了利用該菌株來處理廢水的連續(xù)工藝,以實(shí)現(xiàn)加速氨氮的去除和縮短水利停留時(shí)間(HRT)。與此同時(shí),經(jīng)過改造的菌株還有效地去除了廢水中的多種抗生素。該研究通過生理、化學(xué)、代謝物、轉(zhuǎn)錄組和遺傳分析,闡明了小球藻在廢水中生存的耐受性、氨氮去除和抗生素降解的機(jī)制。最終研究表明,在小球藻中過表達(dá)新鑒定的P450酶可以改善氨氮、有機(jī)氮和抗生素的降解。
這項(xiàng)研究為開發(fā)基于微藻的工藝以改善畜牧業(yè)中的氮和水循環(huán)提供了寶貴的見解。同時(shí),在合成生物學(xué)和環(huán)境工程層面,該研究也為后續(xù)優(yōu)化藻類污水處理技術(shù)提供了新的思路和發(fā)展方向。

文章上線截圖
清潔的水源和食物是人類健康和全球可持續(xù)發(fā)展相互關(guān)聯(lián)的重要資源。工業(yè)化養(yǎng)殖利用大量清潔水,同時(shí)產(chǎn)生大量廢水,對淡水供應(yīng)造成負(fù)擔(dān)。據(jù)估計(jì),畜牧業(yè)每年為了生產(chǎn) 560 億頭牲畜供消費(fèi)會(huì)產(chǎn)生 240 億噸廢水,預(yù)計(jì)到 2050 年消費(fèi)量將超過 1000 億頭牲畜 (Sepúlveda-Mu?oz et al., 2023)。為了滿足這種日益增長的需求,人們建立了大規(guī)模的集中飼養(yǎng)農(nóng)場,需要大量使用激素和抗生素 (Vaishnav et al., 2023)。然而,廢水往往在未進(jìn)行有效營養(yǎng)管理的情況下排放,導(dǎo)致全球 64-97% 的富營養(yǎng)化 (Silva-Gálvez et al., 2024)??股卦趶U水中的積累及向環(huán)境的釋放可能會(huì)對抗生素耐藥性產(chǎn)生潛在的不利影響,加劇與耐藥病原體相關(guān)的現(xiàn)有問題 (Wang et al., 2021)。因此,畜牧業(yè)廢水管理不當(dāng)會(huì)對周圍的淡水生態(tài)系統(tǒng)以及人類健康和安全產(chǎn)生負(fù)面影響。
傳統(tǒng)的畜牧業(yè)廢水處理過程采用兩步法。首先,利用厭氧消化來極大地降低化學(xué)需氧量 (COD)。然后,使用好氧活性污泥氧化去除剩余的營養(yǎng)物質(zhì)。厭氧消化步驟至關(guān)重要,因?yàn)楦?COD 會(huì)抑制污泥的生長 (Wang et al., 2016)。厭氧消化還有一個(gè)額外的好處,那就是以沼氣的形式創(chuàng)造綠色能源。在中國,每年通過加工牲畜糞便生產(chǎn) 145 億立方米沼氣 (Ran et al., 2021)。然而,厭氧消化后殘留的總氮(TN)較高,尤其是氨氮可高達(dá) 1000-2000 mg/L,使得厭氧消化出水中的碳氮比(COD/TN)較低,污泥沒有足夠的碳源進(jìn)行生長,從而降低了第二步中活性污泥去除營養(yǎng)物質(zhì)的能力 (Zhang et al., 2022)。基于微藻的處理工藝,其好處在于微藻獨(dú)特的生理和代謝途徑使得其可以通過固定 CO2合成有機(jī)碳源,從而生長在低 COD/TN的污水環(huán)境中。然而,微藻對于高氨氮和復(fù)合型抗生素廢水的適應(yīng)能力較差,同時(shí)目前基于微藻的處理工藝需要較長的水力停留時(shí)間 (HRT),約為 8-12 天 (de Mendon?a et al., 2018),這限制了它們在商業(yè)工藝中的廣泛應(yīng)用。為此,本研究旨在探索小球藻去除畜牧業(yè)厭氧廢水中的氮和抗生素的潛在機(jī)制。并通過設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)(DBTL)策略,將環(huán)境工程和合成生物學(xué)方法相結(jié)合,用以去除廢水中的氮和異類污染物以及縮短水力停留時(shí)間。
定向進(jìn)化小球藻對畜牧業(yè)廢水的處理
利用定向進(jìn)化技術(shù),篩選到了新型小球藻(M5)能夠快速地去除廢水中的總氮(TN),氨氮(NH4-N)和總磷(TP)。在鴨場厭氧廢水中實(shí)現(xiàn)了 192 mg TN/L/d、177 mg NH4-N/L/d 和 2 mg TP/L/d 的去除率,在養(yǎng)豬場厭氧廢水中實(shí)現(xiàn)了 160 mg TN/L/d、125 mg NH4-N/L/d 和 6 mg TP/L/d 的去除率 (圖1a 和b)。與之前發(fā)表的研究相比,在TN含量高出 4 倍的情況下,M5對TN去除率仍舊高出 8 倍 (Wang et al., 2016)。同時(shí),發(fā)現(xiàn)M5可有效去除鴨場廢水中的強(qiáng)力霉素、磺胺甲氧噠嗪、環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶(圖 1c)。在豬場廢水中,也可有效去除磺胺甲氧噠嗪、磺胺二甲嘧啶、強(qiáng)力霉素、土霉素、磺胺間甲氧嘧啶、培氟沙星、金霉素和四環(huán)素(圖 1d)。




圖 1. 畜禽廢水的批量處理工藝。處理(a)鴨場和(b)豬場廢水時(shí)細(xì)胞密度、化學(xué)需氧量 (COD)、總氮(TN)、銨氮(NH4-N)、總有機(jī)氮(TON)和總磷(TP)濃度的變化。M5 處理后(c)鴨場和(d)豬場廢水中抗生素的去除率
連續(xù)反饋式處理系統(tǒng)的搭建
為了能夠讓 M5 投入商業(yè)應(yīng)用,并且與傳統(tǒng)的活性污泥法的水力停留時(shí)間相匹配(HRT=4-6天),我們利用了 DBTL 策略來建立了一套新型兩級連續(xù)反饋式處理系統(tǒng)(CFP)。經(jīng)過了長達(dá)兩個(gè)月的觀察,CFP工藝在水力停留時(shí)間為4天的情況下實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的污染物降解率,其中在鴨場廢水中的去除率為 334 mg TN/L/d、306 mg NH4-N/L/d 和 4 mg TP/L/d,在豬場廢水中的去除率為 213 mg TN/L/d、213 mg NH4-N/L/d 和 10 mg TP/L/d。即使在將系統(tǒng)總工作體積減少 43% 后,使用CFP工藝的 NH4-N 去除率仍比搖瓶實(shí)驗(yàn)高出 70%。另一方面,在對 CFP 系統(tǒng)中抗生素濃度的分析表明,林可霉素、恩諾沙星、磺胺甲氧噠嗪、螺旋霉素、磺胺嘧啶和泰樂菌素的去除效果均有所改善(圖 2f、g)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)了該套工藝已經(jīng)可以和傳統(tǒng)的活性污泥法的處理效率不相上下了,甚至在總氮的處理方面比污泥法更勝一籌。




圖 2. 連續(xù)反饋工藝處理畜牧業(yè)廢水。(a)連續(xù)反饋系統(tǒng)示意圖。處理(b、c)鴨場厭氧消化廢水(DFWD)和(d、e)養(yǎng)豬場厭氧消化廢水(PWD)后,I 和 II 階段的細(xì)胞密度、化學(xué)需氧量(COD)、總氮(TN)、銨氮(NH4-N)和總磷(TP)濃度。從(f)DFWD 和(g)PWD 中抗生素去除率
新型P450酶用于畜牧業(yè)廢水處理
為了進(jìn)一步探索 M5 降解廢水的潛在機(jī)理,我們通過轉(zhuǎn)錄組測序挖掘了高表達(dá)的 P450 酶,其中經(jīng)過分析和比對,發(fā)現(xiàn)了一段完整的高表達(dá) P450 酶的基因(A23292)。為了驗(yàn)證這段基因的潛在功能,將其重新在未進(jìn)化的原始小球藻(M2)細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行了過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。研究表明 A23292 過表達(dá)的小球藻細(xì)胞(M2+N)足以耐受畜牧業(yè)廢水中的抑制化合物。經(jīng)過M2過表達(dá)密碼子優(yōu)化的 A23292 處理后(M2+CO),鴨場和豬場廢水中的氨氮去除率分別提高了 11 倍和 5 倍(圖 3a、b)。因此,氨氮去除率的提高可能是由于 A23292 從廢水中去除了生長抑制化學(xué)物質(zhì),從而促進(jìn)了更高的細(xì)胞生長,從而加速了氨氮的去除。在 A23292 過表達(dá)后,鴨場和豬場廢水中實(shí)現(xiàn)的 NH4-N 去除率分別為 470 mg NH4-N/L/d 和 240 mg NH4-N/L/d。另一方面,M2 過表達(dá)密碼子優(yōu)化的 A23292 后,林可霉素、恩諾沙星和泰樂菌素的去除率分別提高了 60%、40% 和 130%(圖 3c)。這些增加表明A23292參與了這些抗生素的水解作用。
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圖 3. 細(xì)胞色素 P450 對畜牧業(yè)廢水的解毒測試。通過 M2 與空載體對照(M2+EV)、M5、過表達(dá)天然 A23292 的 M2(M2+N)和過表達(dá)密碼子優(yōu)化的 A23292 的 M2(M2+CO),去除(a)鴨場和(b)豬場廢水中的化學(xué)需氧量(COD)、總氮(TN)、銨氮(NH4-N)、總有機(jī)氮(TON)和總磷(TP)。(c)在 BG-11 中,通過過表達(dá)密碼子優(yōu)化的 A2329 的 M2 抗生素(500 μg/L)去除率
本研究主要提供了兩種改進(jìn)基于藻類的高氨氮畜牧業(yè)厭氧消化廢水的處理方法。一種方法是基于合成生物學(xué)改造,通過過表達(dá)密碼子優(yōu)化后的 P450 酶來增強(qiáng)對有毒物質(zhì)的解毒。另一種是基于 DBTL 策略,開發(fā)通過細(xì)胞回流步驟來增強(qiáng)細(xì)胞的毒性耐受性并保持細(xì)胞繁殖能力。這兩種方法已在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上得到驗(yàn)證,并且為以下學(xué)科領(lǐng)域和工程方面提供了一些新的思路和應(yīng)用:1)通過蛋白質(zhì)工程改進(jìn)小球藻 P450 酶的活性;2)分析結(jié)構(gòu)并探索 P450 酶在其他類型廢水中的潛在功能;3)可以研究基于藻類的 CFP 工藝與活性污泥工藝的結(jié)合進(jìn)一步去除 COD 和 TN。
中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院的博士后肖睿為文章的第一作者,正高級工程師Howard H. Chou為文章的通訊作者。本研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中國博士后科學(xué)基金以及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院的支持。
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