Metabolic Engineering & Adv. Funct. Mater. | 陳業(yè)團隊開發(fā)高性能酵母誘導(dǎo)系統(tǒng)
近日,中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院陳業(yè)團隊于國際期刊Metabolic Engineering發(fā)表研究論文"Versatile xylose and arabinose genetic switches development for yeasts"。該研究利用來自曲霉菌種的轉(zhuǎn)錄激活因子XlnR和AraRA以及細菌轉(zhuǎn)錄阻遏因子XylR和AraRR,在酵母中開發(fā)了基于廉價誘導(dǎo)劑的高誘導(dǎo)強度,低泄漏的木糖和阿拉伯糖誘導(dǎo)系統(tǒng)。
釀酒酵母作為重要的真核模式生物和細胞工廠,已經(jīng)有大量的天然或人工誘導(dǎo)系統(tǒng)被開發(fā)。但是,用于實際生產(chǎn)的大規(guī)模發(fā)酵的誘導(dǎo)系統(tǒng)依然局限于內(nèi)源的半乳糖(GAL)系統(tǒng)。然而,半乳糖誘導(dǎo)系統(tǒng)存在若干不足,主要表現(xiàn)在對葡萄糖的抑制作用導(dǎo)致生長與生產(chǎn)過程難以分離,以及復(fù)雜的內(nèi)源調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在不同營養(yǎng)條件下導(dǎo)致誘導(dǎo)動力學(xué)行為的復(fù)雜性。此外,基因表達的誘導(dǎo)依賴于易降解且成本較高的半乳糖。D-木糖和L-阿拉伯糖作為農(nóng)業(yè)廢棄物(如秸稈)水解產(chǎn)物的主要組分,具有成本低廉的優(yōu)勢。鑒于釀酒酵母無法天然降解這些糖類,它們成為理想的專一性誘導(dǎo)劑,可用于生產(chǎn)大量化學(xué)品或蛋白質(zhì)。
自2015年以來,科學(xué)家已經(jīng)在酵母中開發(fā)了一些木糖基因表達誘導(dǎo)系統(tǒng)。過往的木糖誘導(dǎo)系統(tǒng)大多基于原核生物的阻遏轉(zhuǎn)錄因子XylRR構(gòu)建,但是這些系統(tǒng)都有一個普便存在的問題:最大誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平偏低,且轉(zhuǎn)錄因子的濃度需要細調(diào)以避免引發(fā)宿主生長毒性。內(nèi)在調(diào)控原理-阻遏轉(zhuǎn)錄因子的去阻遏以及原核生物與真核生物的轉(zhuǎn)錄激活機制的截然不同,決定了很難改造已有的木糖轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)系統(tǒng)。

文章上線截圖
絲狀真菌是生態(tài)環(huán)境中的分解者,具有強大的分解代謝能力,因此研究團隊著重在這類菌種中篩選能響應(yīng)木糖及阿拉伯糖的轉(zhuǎn)錄激活因子。通過構(gòu)建基于熒光報告基因的篩選系統(tǒng),團隊最終找到了來自構(gòu)巢曲霉和黑曲霉的轉(zhuǎn)錄激活因子-XlnR (AN7610)和AraRA (An04g08600),能在釀酒酵母中分別劑量響應(yīng)木糖及阿拉伯糖并啟動下游基因轉(zhuǎn)錄表達。
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為克服天然啟動子的局限性,如序列冗長、轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號多樣及結(jié)構(gòu)復(fù)雜性,研究團隊采用結(jié)構(gòu)緊湊的釀酒酵母ADH2強誘導(dǎo)型啟動子作為基礎(chǔ),將XlnR的結(jié)合一致性序列xlno替換ADR1的結(jié)合序列,成功開發(fā)出響應(yīng)木糖的半合成啟動子,顯著增強了木糖誘導(dǎo)下的基因轉(zhuǎn)錄表達。通過構(gòu)建TSS與TATA-box、TATA-box與poly(A)區(qū)域間隔序列的文庫,并調(diào)整轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序(motif)的數(shù)量,成功開發(fā)出具有廣泛動態(tài)范圍的全合成誘導(dǎo)啟動子。
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基于轉(zhuǎn)錄激活因子的誘導(dǎo)系統(tǒng)通常泄漏水平較高,為應(yīng)對泄漏水平較高的問題,研究團隊引入了原核生物的轉(zhuǎn)錄阻遏抑制信號,并設(shè)計了轉(zhuǎn)錄激活/抑制的雙調(diào)控系統(tǒng)。這一創(chuàng)新使得木糖雙調(diào)控系統(tǒng)的動態(tài)范圍擴展至4000倍以上,且最大誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性達到釀酒酵母強組成型啟動子TDH3活性的兩倍以上。同樣阿拉伯糖雙調(diào)控誘導(dǎo)系統(tǒng)動態(tài)范圍達300倍,最大誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性與TDH3啟動子活性相當(dāng)。重要的是,農(nóng)業(yè)廢棄物如玉米芯未經(jīng)處理的水解物也可以充分激活該木糖誘導(dǎo)系統(tǒng)。最后,研究團隊綜合比較了本研究開發(fā)的木糖及阿拉伯糖誘導(dǎo)系統(tǒng)與釀酒酵母中常用的誘導(dǎo)系統(tǒng)(天然系統(tǒng)如GAL系統(tǒng),Cu2+誘導(dǎo)啟動子PCUP1,甲硫氨酸抑制啟動子PMET3以及基于雌激素受體ER的合成誘導(dǎo)系統(tǒng)LexA-ER-VP16/B112),證實木糖雙調(diào)控系統(tǒng)就調(diào)控嚴謹性,誘導(dǎo)激活水平、動態(tài)范圍、誘導(dǎo)速度和對宿主的生長影響方面優(yōu)于現(xiàn)有系統(tǒng)。
研究團隊驗證了這兩套誘導(dǎo)系統(tǒng)在高滴度(>100 mg/L)芳樟醇生產(chǎn)中的實用性,同時證實了使用玉米芯水解物作為唯一碳源和誘導(dǎo)劑來源,也能實現(xiàn)高滴度芳樟醇的生產(chǎn)。最后,團隊也證明了基于XlnR的木糖誘導(dǎo)系統(tǒng)可遷移到工業(yè)菌株如畢赤酵母、病原菌如光滑念珠菌和白色念珠菌(CUG支系酵母)。在畢赤酵母中,基于XlnR的木糖誘導(dǎo)系統(tǒng)的最大誘導(dǎo)水平高于其經(jīng)典的甲醇誘導(dǎo)系統(tǒng),并證實了其用于生產(chǎn)分泌蛋白的實用性。
本研究不僅為酵母提供了強大的遺傳開關(guān),還提出了一種將激活/抑制信號整合到合成啟動子中的通用策略,以實現(xiàn)最優(yōu)性能。

木糖及阿拉伯糖誘導(dǎo)系統(tǒng)開發(fā)策略,設(shè)計原理及應(yīng)用
本文第一作者是中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院助理研究員郭淑慧,通訊作者是中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院研究員陳業(yè)。該工作獲得了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金,以及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院的支持。
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團隊相關(guān)亮點成果
通過與該研究相似的轉(zhuǎn)錄因子重構(gòu)結(jié)合合成啟動子方法,以及對于轉(zhuǎn)錄因子表達量、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域及啟動子模塊的精準設(shè)計,可以在釀酒酵母及大腸桿菌中對于任意轉(zhuǎn)錄信號進行優(yōu)化。基于該方法,陳業(yè)團隊與湖南大學(xué)的合作成果,以"On-Chip Engineered Living Materials as Field-Deployable Biosensing Laboratories for Multiplexed Detection"為題,已在Advanced Functional Materials期刊上發(fā)表,中國科學(xué)院大學(xué)碩士黎欣睿完成了細胞傳感器的開發(fā)。

原文鏈接
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202416830

基于微流控芯片的現(xiàn)場可部署的ELM生物傳感實驗室(ELMlab-on-Chip)設(shè)計原理
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