ACS Sensors | 基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的可編程適配體傳感器
12月13日,中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所馬英新課題組和西北農林科技大學郁堯博士合作在ACS Sensors上發(fā)表了題為Programmable Aptasensor for Regulating CRISPR/Cas12a Activity的封面文章。本研究開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的可編程適配體傳感器檢測平臺,主要包括適配體識別元件和CRISPR/Cas12a信號轉導及放大元件。該平臺無需調整crRNA,只需簡單地改變適配體序列和locker DNA長度即可實現(xiàn)不同目標物檢測。當以SARS-CoV-2 S蛋白和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)作為特異性靶標進行檢測時,檢測限分別為0.06 pM和0.06 M。該平臺與側流免疫分析相結合后能夠在一個小時內實現(xiàn)可視化檢測,展現(xiàn)了其作為便攜式檢測的潛力。
近年來,成簇規(guī)律間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)系統(tǒng)以其操作簡單、攜帶方便、特異性高等優(yōu)點,廣泛應用于分子診斷。CRISPR RNA (crRNA)與靶標DNA結合后,能夠激活Cas12a的順式切割活性,對靶標雙鏈DNA的特異性位點進行切割,并能進一步對環(huán)境中游離的單鏈DNA進行非特異性切割,產生熒光信號。然而,由于CRISPR系統(tǒng)無法直接識別蛋白質或小分子,因此依賴信號轉導策略來建立連接。適配體是一種對靶標具有高度親和力和高特異性的穩(wěn)定的DNA或RNA分子,能夠將靶標的識別轉化為信號的輸出,具有穩(wěn)定性好、制備成本低、靶標范圍廣等優(yōu)點。適配體在生物傳感中的應用有效地克服了基于CRISPR系統(tǒng)的免疫分析的局限性。
基于此,團隊開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的可編程適配體傳感器檢測平臺,并篩選得到了最佳長度的locker DNA,用于蛋白質和小分子的檢測。如圖1所示,當該平臺主要包括一段由適配體序列、locker DNA和crRNA識別序列互補雜交而成的單鏈DNA發(fā)夾結構,通過T4 DNA聚合酶的聚合作用將莖環(huán)結構延伸,激活CRISPR/Cas12a的反式切割活性并產生熒光信號;當與靶標物(SARS-CoV-2 S蛋白或ATP)特異性結合后發(fā)生構象變化,T4聚合酶無法正常延伸,從而降低CRISPR/Cas12a產生的熒光信號,最終實現(xiàn)對蛋白質和小分子的高靈敏檢測。
在這項研究中,團隊首先選擇SARS-CoV-2 S蛋白和ATP作為特異性檢測靶標,用于評估開發(fā)的適配體傳感器檢測平臺進行蛋白質和小分子分析的可行性。實驗結果表明,該平臺可以有效地識別靶標物,并能通過適配體的構象變化調節(jié)Cas12a的切割活性。隨后,團隊對適配體傳感器進行結構優(yōu)化,當locker DNA長度分別為7nt和4nt時,適配體與靶標物結合后能發(fā)生穩(wěn)定的構象變化,并獲得最佳信噪比。利用該平臺檢測SARS-CoV-2 S蛋白時發(fā)現(xiàn),隨著S蛋白濃度逐漸增加,熒光信號逐漸下降且信噪比呈現(xiàn)穩(wěn)定的線性關系(如圖2A-C),檢測效果優(yōu)于商用ELISA檢測試劑盒(如圖2D)。此外,當與其他非靶標蛋白同時檢測時,該平臺也對S蛋白展現(xiàn)出良好的檢測特異性(如圖2E)。在與陰性樣本VSV-G假病毒進行實驗對照時,SARS-CoV-2假病毒產生顯著的熒光變化,表明該平臺在檢測實際樣本時的100%準確性(如圖2F)。在改變不同的適配體序列和locker DNA長度后,可以同樣的檢測效率實現(xiàn)對ATP的高特異性檢測,進一步驗證了該平臺的檢測穩(wěn)定性。最后,團隊還將該平臺與側流免疫層析技術相結合(如圖3),在一小時內實現(xiàn)了對靶標物的可視化檢測,證實了其在POCT中的潛在應用。
適配體傳感器檢測平臺結合靶標物和適配體的高親和力結合作用及CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的高效信號轉導和輸出功能,實現(xiàn)了對蛋白質/小分子快速且靈敏的檢測。同時,該檢測平臺為提高適配體傳感器的通用性和易操作性提供了新的見解。
西北農林科技大學郁堯博士、中國科學院深圳先進院與天津科技大學聯(lián)合培養(yǎng)碩士研究生李巧玉為文章的并列第一作者。中國科學院深圳先進院合成生物學研究所的馬英新研究員和毛國斌副研究員為該論文的共同通訊作者。
該項目得到了國家自然科學基金、科技部、中國科學院、廣東省、深圳市及深圳合成生物學創(chuàng)新研究院等多個項目的支持。
圖1 適配體傳感器檢測平臺的設計原理
圖2 適配體傳感器用于SARS-CoV-2 S蛋白的分析
圖3 適配體傳感器檢測平臺與側流免疫層析相結合
補充封面圖(supplementary cover story) 基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的可編程適配體傳感器
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