ACS Sensors | 基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的可編程適配體傳感器
12月13日,中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所馬英新課題組和西北農(nóng)林科技大學(xué)郁堯博士合作在ACS Sensors上發(fā)表了題為Programmable Aptasensor for Regulating CRISPR/Cas12a Activity的封面文章。本研究開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的可編程適配體傳感器檢測平臺,主要包括適配體識別元件和CRISPR/Cas12a信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及放大元件。該平臺無需調(diào)整crRNA,只需簡單地改變適配體序列和locker DNA長度即可實(shí)現(xiàn)不同目標(biāo)物檢測。當(dāng)以SARS-CoV-2 S蛋白和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)作為特異性靶標(biāo)進(jìn)行檢測時(shí),檢測限分別為0.06 pM和0.06 M。該平臺與側(cè)流免疫分析相結(jié)合后能夠在一個(gè)小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)可視化檢測,展現(xiàn)了其作為便攜式檢測的潛力。
近年來,成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)系統(tǒng)以其操作簡單、攜帶方便、特異性高等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于分子診斷。CRISPR RNA (crRNA)與靶標(biāo)DNA結(jié)合后,能夠激活Cas12a的順式切割活性,對靶標(biāo)雙鏈DNA的特異性位點(diǎn)進(jìn)行切割,并能進(jìn)一步對環(huán)境中游離的單鏈DNA進(jìn)行非特異性切割,產(chǎn)生熒光信號。然而,由于CRISPR系統(tǒng)無法直接識別蛋白質(zhì)或小分子,因此依賴信號轉(zhuǎn)導(dǎo)策略來建立連接。適配體是一種對靶標(biāo)具有高度親和力和高特異性的穩(wěn)定的DNA或RNA分子,能夠?qū)袠?biāo)的識別轉(zhuǎn)化為信號的輸出,具有穩(wěn)定性好、制備成本低、靶標(biāo)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。適配體在生物傳感中的應(yīng)用有效地克服了基于CRISPR系統(tǒng)的免疫分析的局限性。
基于此,團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的可編程適配體傳感器檢測平臺,并篩選得到了最佳長度的locker DNA,用于蛋白質(zhì)和小分子的檢測。如圖1所示,當(dāng)該平臺主要包括一段由適配體序列、locker DNA和crRNA識別序列互補(bǔ)雜交而成的單鏈DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu),通過T4 DNA聚合酶的聚合作用將莖環(huán)結(jié)構(gòu)延伸,激活CRISPR/Cas12a的反式切割活性并產(chǎn)生熒光信號;當(dāng)與靶標(biāo)物(SARS-CoV-2 S蛋白或ATP)特異性結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象變化,T4聚合酶無法正常延伸,從而降低CRISPR/Cas12a產(chǎn)生的熒光信號,最終實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)和小分子的高靈敏檢測。
在這項(xiàng)研究中,團(tuán)隊(duì)首先選擇SARS-CoV-2 S蛋白和ATP作為特異性檢測靶標(biāo),用于評估開發(fā)的適配體傳感器檢測平臺進(jìn)行蛋白質(zhì)和小分子分析的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該平臺可以有效地識別靶標(biāo)物,并能通過適配體的構(gòu)象變化調(diào)節(jié)Cas12a的切割活性。隨后,團(tuán)隊(duì)對適配體傳感器進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,當(dāng)locker DNA長度分別為7nt和4nt時(shí),適配體與靶標(biāo)物結(jié)合后能發(fā)生穩(wěn)定的構(gòu)象變化,并獲得最佳信噪比。利用該平臺檢測SARS-CoV-2 S蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn),隨著S蛋白濃度逐漸增加,熒光信號逐漸下降且信噪比呈現(xiàn)穩(wěn)定的線性關(guān)系(如圖2A-C),檢測效果優(yōu)于商用ELISA檢測試劑盒(如圖2D)。此外,當(dāng)與其他非靶標(biāo)蛋白同時(shí)檢測時(shí),該平臺也對S蛋白展現(xiàn)出良好的檢測特異性(如圖2E)。在與陰性樣本VSV-G假病毒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對照時(shí),SARS-CoV-2假病毒產(chǎn)生顯著的熒光變化,表明該平臺在檢測實(shí)際樣本時(shí)的100%準(zhǔn)確性(如圖2F)。在改變不同的適配體序列和locker DNA長度后,可以同樣的檢測效率實(shí)現(xiàn)對ATP的高特異性檢測,進(jìn)一步驗(yàn)證了該平臺的檢測穩(wěn)定性。最后,團(tuán)隊(duì)還將該平臺與側(cè)流免疫層析技術(shù)相結(jié)合(如圖3),在一小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對靶標(biāo)物的可視化檢測,證實(shí)了其在POCT中的潛在應(yīng)用。
適配體傳感器檢測平臺結(jié)合靶標(biāo)物和適配體的高親和力結(jié)合作用及CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的高效信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和輸出功能,實(shí)現(xiàn)了對蛋白質(zhì)/小分子快速且靈敏的檢測。同時(shí),該檢測平臺為提高適配體傳感器的通用性和易操作性提供了新的見解。
西北農(nóng)林科技大學(xué)郁堯博士、中國科學(xué)院深圳先進(jìn)院與天津科技大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)碩士研究生李巧玉為文章的并列第一作者。中國科學(xué)院深圳先進(jìn)院合成生物學(xué)研究所的馬英新研究員和毛國斌副研究員為該論文的共同通訊作者。
該項(xiàng)目得到了國家自然科學(xué)基金、科技部、中國科學(xué)院、廣東省、深圳市及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院等多個(gè)項(xiàng)目的支持。
圖1 適配體傳感器檢測平臺的設(shè)計(jì)原理
圖2 適配體傳感器用于SARS-CoV-2 S蛋白的分析
圖3 適配體傳感器檢測平臺與側(cè)流免疫層析相結(jié)合
補(bǔ)充封面圖(supplementary cover story) 基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的可編程適配體傳感器
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