Analytical Chemistry | 基于RPA-CRISPR/Cas12a系統(tǒng)構(gòu)建快速、靈敏、雙模式的非洲豬瘟檢測(cè)新策略
5月11日,中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所馬英新課題組與湖北大學(xué)印文博士合作在Analytical Chemistry上發(fā)表了題為《Fluorescence and Colorimetric Analysis of African Swine Fever Virus Based on RPA-Assisted CRISPR/Cas12a Strategy》的補(bǔ)充封面論文。該論文首次構(gòu)建了基于RPA-CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的非洲豬瘟病毒(ASFV)比色-熒光雙模式檢測(cè)策略,通過(guò)構(gòu)建新型磁珠-酶報(bào)告系統(tǒng),結(jié)合RPA-CRISPR/Cas12a技術(shù),實(shí)現(xiàn)了對(duì)ASFV基因的比色-熒光雙模式精準(zhǔn)檢測(cè)。該方法能實(shí)現(xiàn)對(duì)單拷貝病毒基因組檢測(cè),可用于便攜式可視化診斷,且在臨床樣本應(yīng)用中展現(xiàn)了良好的檢測(cè)性能,為病毒感染的快速、精準(zhǔn)診斷提供了有力工具。

文章上線截圖
上線鏈接:https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acs.analchem.3c01033
非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、出血性、高傳染性的豬疾病。迄今為止,仍然沒(méi)有廣泛有效的疫苗和治療方式用于應(yīng)對(duì)非洲豬瘟,通常依靠快速診斷和撲殺感染豬等手段對(duì)疫情進(jìn)行有效控制。目前,對(duì)于非洲豬瘟的診斷主要依賴(lài)于PCR技術(shù),該技術(shù)依賴(lài)于儀器設(shè)備和專(zhuān)業(yè)操作人員,只能在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行,無(wú)法滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)診斷的需求。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),如重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)等,具有高效、簡(jiǎn)便易行等優(yōu)勢(shì),但其靈敏度有限,難以單獨(dú)用于分子診斷。通過(guò)與CRISPR/Cas系統(tǒng)聯(lián)用,靈敏度顯著提高,可增加分子診斷的準(zhǔn)確性。然而,目前常用的單模式熒光檢測(cè)法或比色檢測(cè)法易受到環(huán)境干擾,造成檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。
本研究開(kāi)發(fā)了一種結(jié)合RPA、CRISPR/Cas12a和磁珠-酶新型報(bào)告系統(tǒng),用于ASFV基因的快速精準(zhǔn)診斷的方法。如圖1所示,biotin-ssDNA-azide與DBCO修飾的堿性磷酸酶(ALP)通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)合成biotin-ssDNA-ALP,biotin-ssDNA-ALP與鏈霉親和素修飾的磁珠(SA-MB)結(jié)合獲得MB-ssDNA-ALP報(bào)告系統(tǒng)。用RPA擴(kuò)增ASFV基因序列,獲得擴(kuò)增子,擴(kuò)增子與Cas12a-crRNA復(fù)合物結(jié)合,激活Cas12a反式切割活性,切割MB-ssDNA-ALP上的ssDNA,釋放ALP;ALP催化pNPP水解生成pNP,引起比色信號(hào)變化,再加入量子點(diǎn)作為熒光報(bào)告子,實(shí)現(xiàn)比色和熒光的雙模式信號(hào)輸出。

圖1 探針構(gòu)建及ASFV檢測(cè)原理圖。biotin-ssDNA-azide與DBCO-ALP通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)獲得biotin-ssDNA-ALP,biotin-ssDNA-ALP與SA-MB偶聯(lián)獲得MB-ssDNA-ALP報(bào)告子。RPA擴(kuò)增ASFV基因,擴(kuò)增子激活Cas12a-crRNA復(fù)合物,Cas12a非特異性切割biotin-ssDNA-ALP報(bào)告子,釋放ALP;ALP水解pNPP,生成黃色pNP,加入藍(lán)色QDs后,在內(nèi)濾效應(yīng)作用下,藍(lán)色QDs熒光被猝滅。
在該研究中,團(tuán)隊(duì)首先合成、表征了biotin-ssDNA-ALP,并驗(yàn)證了biotin-ssDNA-N3與DBCO修飾ALP的偶聯(lián)以及MB-ssDNA-ALP探針的合成。然后,考察了RPA擴(kuò)增ASFV基因的能力。以高度保守的ASFV B646L基因?yàn)榘袠?biāo),設(shè)計(jì)了三對(duì)RPA引物,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了三對(duì)引物都可高效擴(kuò)增ASFV基因。接著,驗(yàn)證了CRISPR/Cas12a靶向剪切ASFV基因的能力。設(shè)計(jì)靶向三個(gè)RPA擴(kuò)增子序列的crRNA,利用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證了Cas12a被激活并切割RPA擴(kuò)增子。最后,結(jié)合合成的MB-ssDNA-ALP探針、RPA-CRISPR/Cas12a系統(tǒng)以及藍(lán)色CdZnSe QDs,實(shí)現(xiàn)了對(duì)ASFV基因的比色-熒光雙模式精準(zhǔn)檢測(cè),靈敏度達(dá)20 copies/mL,可視化檢測(cè)104 copies/mL(圖 2A-2D)。磁分離技術(shù)的使用可有效降低背景信號(hào),實(shí)現(xiàn)高信噪比檢測(cè)。對(duì)比發(fā)現(xiàn)本研究開(kāi)發(fā)的檢測(cè)方法靈敏度高于qPCR,且具有良好的特異性,探針不與其它豬疾病相關(guān)病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)。同時(shí),還探究了該方法在實(shí)際樣本中的檢測(cè)能力,對(duì)12份豬血真實(shí)樣本進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示該檢測(cè)方法具有100%的準(zhǔn)確度(圖2E和2F)。本方法結(jié)合熒光法的高靈敏度和比色法的易讀性,具有良好的靈敏度、便攜性和特異性,為病毒感染的快速、精準(zhǔn)診斷提供了有效工具。

圖2 比色-熒光雙模式檢測(cè)ASFV基因。(A)不同濃度ASFV基因下,pNP的紫外光譜。(B)400 nm處吸光度與ASFV基因濃度的對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系。(C)不同濃度ASFV基因下,CdZnSe QDs的熒光光譜。(D)熒光強(qiáng)度變化與ASFV基因濃度的對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系。比色(E)和熒光(F)檢測(cè)方法用于臨床樣本的分析結(jié)果??梢暬瘷z測(cè)結(jié)果均列于圖片上方。
中科院深圳先進(jìn)院合成生物學(xué)研究所的毛國(guó)斌副研究員和中科院深圳先進(jìn)院與華中農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)碩士研究生羅杏為文章并列第一作者。中科院深圳先進(jìn)院合成生物學(xué)研究所的馬英新研究員、毛國(guó)斌副研究員和湖北大學(xué)印文博士為該論文的共同通訊作者。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)何進(jìn)教授、王璕副教授參與了該研究,復(fù)旦大學(xué)孔繼烈教授提供了樣本支持。該項(xiàng)目得到國(guó)家自然科學(xué)基金、科技部、中國(guó)科學(xué)院、廣東省、深圳市及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院等多個(gè)項(xiàng)目的支持。

補(bǔ)充封面(supplementary cover story)
超高靈敏CRISPR/Cas12a分子診斷傳感器構(gòu)建用于非洲豬瘟病毒感染快速篩查
PI與課題組簡(jiǎn)介:
馬英新博士,中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院研究員,博士生導(dǎo)師,國(guó)家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年項(xiàng)目獲得者,國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃青年首席科學(xué)家,近5年主持1項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年項(xiàng)目、1項(xiàng)科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃青年項(xiàng)目、1項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目、1項(xiàng)廣東省杰出青年基金項(xiàng)目、1項(xiàng)深圳市優(yōu)秀科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)項(xiàng)目、1項(xiàng)中科院深圳先進(jìn)院優(yōu)青項(xiàng)目和1項(xiàng)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目,并獲批了中國(guó)科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)、深圳市高層次人才、博士后創(chuàng)新人才支持計(jì)劃等人才計(jì)劃。
以第一/通訊作者身份在J. Am. Chem. Soc.、Nat. Commun.、ACS Nano、Sci China Life Sci、Anal. Chem.、ACS Appl. Mater. Interfaces、Nano Res等國(guó)際著名雜志發(fā)表論文30余篇。
課題組長(zhǎng)期面向:
1)有微生物學(xué)、噬菌體學(xué)、合成生物學(xué)、分子生物學(xué)、分析化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等學(xué)科研究背景者;
2)有分子病毒學(xué)、噬菌體學(xué)、合成生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物傳感技術(shù)開(kāi)發(fā)等工作經(jīng)驗(yàn)者;
3)納米合成生物學(xué)等交叉學(xué)科背景的專(zhuān)業(yè)人才招聘博士后。
有意申請(qǐng)者請(qǐng)將個(gè)人簡(jiǎn)歷(要求為PDF)以發(fā)送至:yx.ma1@siat.ac.cn,簡(jiǎn)歷及郵件標(biāo)題注明“應(yīng)聘崗位-學(xué)校名稱(chēng)-專(zhuān)業(yè)-姓名”。
附件下載: