JAFC|釀酒酵母細胞工廠高效合成維生素B5
維生素B5(又稱D-泛酸)在細胞中參與碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝,是人體必需的維生素之一,被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、飼料、食品、保健等領(lǐng)域。D-泛酸目前主要通過化學-酶法生產(chǎn),該過程涉及大量含氰廢水的處理,隨著人們對環(huán)境保護的重視,該方法面臨著巨大的挑戰(zhàn)。微生物細胞工廠因其綠色環(huán)保的特點,是實現(xiàn)D-泛酸生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的突破口。
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文章鏈接:https://doi.org/10.1021/acs.jafc.3c01082
武漢大學劉天罡教授與中科院深圳先進技術(shù)研究院馬田副研究員合作在Journal of Agricultural and Food Chemistry上發(fā)表題為“Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for Vitamin B5 Production”的研究成果。該研究在釀酒酵母中構(gòu)建了D-泛酸的高效合成途徑,并通過系統(tǒng)代謝工程對合成途徑進行優(yōu)化,最終使用廉價培養(yǎng)基且無前體、無誘導(dǎo)劑、無抗生素添加,實現(xiàn)4.1 g/L D-泛酸的合成,是目前報道釀酒酵母從葡萄糖從頭合成D-泛酸的最高產(chǎn)量。
圖1. 本研究涉及的D-泛酸生物合成途徑
D-泛酸合成途徑關(guān)鍵酶的篩選及適配。該研究首先將D-泛酸的生物合成途徑設(shè)計為三個模塊:β-丙氨酸合成模塊、D-泛解酸合成模塊和兩者的縮合模塊,過程涉及7步關(guān)鍵酶(圖1)。將來自細菌、酵母、真菌、藻類、植物、動物等不同物種來源的功能酶以模塊為單位進行篩選,并通過組合篩選獲得最佳的元件適配組合。在釀酒酵母中構(gòu)建了D-泛酸異源合成途徑,并實現(xiàn)利用基本碳源且無前體添加合成D-泛酸。
D-泛酸生物合成途徑的優(yōu)化。為了進一步強化D-泛酸合成途徑,作者對三個模塊的基因進行拷貝數(shù)的優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)D-泛解酸合成模塊、β-丙氨酸合成模塊和前體縮合模塊拷貝數(shù)為3:1:2時,工程菌合成泛酸的能力最強。
另一方面,D-泛酸合成途徑中存在多個競爭途徑,作者圍繞丙酮酸與酮異戊酸兩個關(guān)鍵中間代謝物對不同競爭途徑進行了刪減或削弱。通過對競爭途徑關(guān)鍵基因的敲除,作者發(fā)現(xiàn)leu4、bat1、gpd1和gpd2四個潛在D-泛酸增產(chǎn)的有效位點。隨后,通過過表達pos5平衡細胞內(nèi)的氧化還原力,過表達mae1增加前體丙酮酸,獲得D-泛酸高產(chǎn)菌株。
D-泛酸高產(chǎn)菌的發(fā)酵優(yōu)化。在以上研究中,關(guān)鍵基因的表達受半乳糖誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控,作者將關(guān)鍵調(diào)控基因gal80敲除,使基因的過表達僅通過葡萄糖調(diào)控,獲得工程菌DPA171。在發(fā)酵罐中對菌株DPA171進行發(fā)酵條件優(yōu)化,通過控制補料階段乙醇的濃度在5 g/L以下,在不添加誘導(dǎo)劑、前體、抗生素等成分的條件下,以葡萄糖為碳源從頭合成,實現(xiàn)4.1 g/L D-泛酸的合成。
圖2. 釀酒酵母細胞工廠高產(chǎn)D-泛酸
綜上,本研究首次在釀酒酵母中構(gòu)建了完整的D-泛酸異源合成途徑,并進行系統(tǒng)代謝工程實現(xiàn)以葡萄糖為碳源從頭合成D-泛酸,為構(gòu)建維生素類細胞工廠提供了指導(dǎo)。
本論文以武漢大學碩士生郭加璇為第一作者,以劉天罡教授和馬田副研究員為共同通訊作者。該研究工作得到國家重點研發(fā)計劃和武漢合生科技有限公司支持。
通訊作者簡介:
馬田博士,中國科學院深圳先進技術(shù)研究院副研究員。主要致力于探索微生物高效合成的代謝機理及工程手段以實現(xiàn)目標生物源藥物的綠色制造。研究成果以第一作者或通訊作者發(fā)表在Nature Communications、Metabolic Engineering等。轉(zhuǎn)化成果被評為2018年湖北十大科技事件、2019年湖北省科技進步一等獎。
課題組面向微生物綠色制造方向,現(xiàn)招聘博士后和研究助理,以微生物學、生物化學、分子生物學背景優(yōu)先,歡迎感興趣的同志投遞簡歷至郵箱tian.ma@siat.ac.cn。
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