National Science Review | 利用近紅外光編程細(xì)菌全局表型強(qiáng)化實(shí)體瘤治療效果
近年來,合成生物學(xué)的快速發(fā)展為腫瘤細(xì)菌療法的深度優(yōu)化帶來新的契機(jī)?;诤铣缮飳W(xué)手段,科學(xué)家們能夠利用基因工程改造的微生物或細(xì)胞而非傳統(tǒng)的化學(xué)小分子或生物制劑,作為新型疾病治療方法的開發(fā)基礎(chǔ)。人工設(shè)計(jì)的攜帶有合成基因線路的微生物或細(xì)胞能夠響應(yīng)疾病標(biāo)志物或者外界信號(hào),實(shí)現(xiàn)對藥物釋放位置、釋放時(shí)間和釋放劑量的控制,已逐漸發(fā)展為人類對抗疾病的強(qiáng)有力武器。
在傳統(tǒng)的細(xì)菌改造基礎(chǔ)上,經(jīng)過理性設(shè)計(jì)的基因通路賦予了底盤細(xì)菌更多樣化的治療能力,彌補(bǔ)了天然菌株在腫瘤治療方面的缺陷,腫瘤細(xì)菌療法也因此成為極富應(yīng)用前景的新型腫瘤療法?,F(xiàn)有腫瘤細(xì)菌療法的優(yōu)化策略主要集中在新型藥物的應(yīng)用、新型可控釋放方式的引入等,但是卻忽略了細(xì)菌自身行為對腫瘤治療效果的影響,缺乏對腫瘤治療過程中細(xì)菌行為的持續(xù)控制。腫瘤治療是一個(gè)長期的過程,可控持續(xù)的藥物釋放是提高腫瘤治療效果的關(guān)鍵,雖然在材料領(lǐng)域通過高分子水凝膠和脂質(zhì)等已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了藥物的持續(xù)釋放,但是在腫瘤細(xì)菌療法中仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。
近日,中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所金帆課題組在國際學(xué)術(shù)期刊National Science Review上發(fā)表了題為"Programming the lifestyles of engineered bacteria for cancer therapy"的研究成果。通過合成生物學(xué)的設(shè)計(jì),研究人員成功地將銅綠假單胞菌菌株改造成為具有實(shí)體瘤治療功效的工程菌。在治療過程中,該工程菌的全局表型可被近紅外光的輻照程序精確的控制,即:在弱定殖、定殖以及裂解釋藥三種表型切換,從而更有效的消融瘤體達(dá)到治療效果,具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。深圳先進(jìn)院合成所助理研究員張榮榮為論文共同第一作者及共同通訊作者,金帆研究員為文章通訊作者。
文章上線截圖
在自然界中,銅綠假單胞菌在有利的環(huán)境中處于浮游狀態(tài),其在表面定殖的能力較弱;而在不利的環(huán)境中則會(huì)進(jìn)入生物被膜狀態(tài),其表面定殖能力大大增強(qiáng)。受到自然界中細(xì)菌生存方式的啟發(fā),研究團(tuán)隊(duì)為工程菌設(shè)計(jì)了浮游狀態(tài)和生物被膜狀態(tài)以實(shí)現(xiàn)對其定殖能力的控制,其中浮游狀態(tài)細(xì)菌的定殖能力較弱,能夠減少對正常組織的傷害;而生物被膜狀態(tài)細(xì)菌的定殖能力較強(qiáng),能夠增加其在腫瘤組織內(nèi)的定殖量。研究團(tuán)隊(duì)通過敲除毒力因子調(diào)控蛋白編碼基因vfr和三型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因exoS和exoT構(gòu)建了減毒的銅綠假單胞菌菌株作為腫瘤細(xì)菌療法中的新型底盤菌株。銅綠假單胞菌在浮游狀態(tài)和生物被膜狀態(tài)兩種生活方式之間的切換與第二信使分子環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)的濃度密切相關(guān),為此,研究團(tuán)隊(duì)使用兩個(gè)基因模塊對細(xì)菌胞內(nèi)的c-di-GMP濃度進(jìn)行控制,分別是1)通過組成型啟動(dòng)子表達(dá)磷酸二酯酶PA2133以分解c-di-GMP,使細(xì)菌維持較低的胞內(nèi)c-di-GMP水平,進(jìn)入浮游狀態(tài);2)引入可在近紅外光照射下合成c-di-GMP的光敏蛋白BphS,近紅外光照射可使細(xì)菌胞內(nèi)c-di-GMP水平升高,細(xì)菌進(jìn)入生物被膜狀態(tài)。此外,為了實(shí)現(xiàn)治療藥物的控制釋放,研究團(tuán)隊(duì)為工程菌設(shè)計(jì)了第三種生活方式,即裂解狀態(tài),通過c-di-GMP響應(yīng)型啟動(dòng)子表達(dá)裂解基因,可使細(xì)菌在c-di-GMP升高后進(jìn)入裂解狀態(tài)(圖1)。這樣,細(xì)菌的三種生活方式便均與c-di-GMP的濃度相關(guān)。通過改變近紅外光的照射強(qiáng)度,可以控制活化的BphS蛋白的數(shù)量,進(jìn)而調(diào)節(jié)工程菌胞內(nèi)的c-di-GMP的濃度,從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌生活方式的控制。除了光照強(qiáng)度的影響,理論模擬的結(jié)果表明:PA2133上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS1)與抗終止蛋白Q上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS2)的強(qiáng)度將對使細(xì)菌進(jìn)入不同的生活方式所需的近紅外光光強(qiáng)產(chǎn)生巨大的影響。
為了獲得能夠在不同強(qiáng)度的近紅外光照射下呈現(xiàn)三種生活方式的工程菌,研究團(tuán)隊(duì)對RBS1和RBS2進(jìn)行批量替換,并通過96孔光照裝置對候選菌株進(jìn)行批量篩選,隨后利用顯微鏡進(jìn)行驗(yàn)證,最終得到的工程化菌株被命名為H017(圖2)。通過層級性調(diào)控近紅外光的照射強(qiáng)度可以編程H017的生活方式,當(dāng)對H017施加中等強(qiáng)度-高強(qiáng)度循環(huán)的近紅外光光照程序時(shí),細(xì)菌將進(jìn)入生物被膜狀態(tài)-裂解狀態(tài)生活方式循環(huán)。
為了在體外驗(yàn)證工程菌的三種生活方式在腫瘤治療中的作用,研究團(tuán)隊(duì)在微流通道中進(jìn)行了細(xì)菌-細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)(圖3)。研究團(tuán)隊(duì)首先證實(shí),當(dāng)對指定區(qū)域的細(xì)胞施加不同強(qiáng)度的近紅外光光照時(shí),工程菌能夠精確地在該區(qū)域內(nèi)進(jìn)入對應(yīng)的生活方式。當(dāng)對指定區(qū)域的細(xì)胞施加中等強(qiáng)度-高強(qiáng)度的光照程序時(shí),H017先進(jìn)入生物被膜狀態(tài)并大量定殖在細(xì)胞表面,隨后進(jìn)入裂解狀態(tài)釋放治療藥物造成細(xì)胞壞死。以上結(jié)果表明,能夠通過近紅外光對工程菌的生活方式進(jìn)行高時(shí)空分辨率的控制。此外,綜合對照組實(shí)現(xiàn)的結(jié)果,研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)生物被膜狀態(tài)的藥物累積過程與裂解狀態(tài)的藥物釋放過程是H017殺傷腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵。
隨后,研究團(tuán)隊(duì)使用小鼠皮下瘤模型探究能否通過近紅外光控制工程菌在瘤內(nèi)的生活方式并實(shí)現(xiàn)預(yù)期的功能(圖4)。結(jié)果顯示,在瘤內(nèi)注菌后,避光培養(yǎng)三天組的小鼠(D3)腫瘤組織內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量與注射PBS組沒有顯著差異,表明進(jìn)入浮游狀態(tài)生活方式的細(xì)菌難以在腫瘤內(nèi)定殖;中等光強(qiáng)照射三天組的小鼠(M3)腫瘤組織內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量與D3組相比顯著增加,表明進(jìn)入生物被膜狀態(tài)生活方式的細(xì)菌在腫瘤組織內(nèi)的定殖能力大大增強(qiáng);中等光強(qiáng)照射兩天高光強(qiáng)照射一天組的小鼠(M2-H1)與M3組相比,細(xì)菌數(shù)量顯著降低,且M2-H1組的腫瘤組織切片中能夠看出明顯的壞死區(qū)域,表明細(xì)菌裂解后釋放藥物并殺傷了腫瘤細(xì)胞;中等光強(qiáng)照射兩天高光強(qiáng)照射一天再中等光強(qiáng)照射兩天組的小鼠(M2-H1-M2)與M2-H1組相比,細(xì)菌數(shù)量再次上升,這表明細(xì)菌在中等光強(qiáng)照射后,再次進(jìn)入定殖生長狀態(tài)。此外,在中等光強(qiáng)近紅外光照射七天后,瘤內(nèi)的工程菌仍然具有裂解能力,表明該基因線路具有較好的穩(wěn)定性。綜合以上結(jié)果可知,不同強(qiáng)度的近紅外光照射能夠使瘤內(nèi)細(xì)菌進(jìn)入對應(yīng)的生活方式并實(shí)現(xiàn)預(yù)期的功能,而通過連續(xù)改變的光照程序能夠?qū)崿F(xiàn)對瘤內(nèi)細(xì)菌生活方式的持續(xù)控制。
最后,研究團(tuán)隊(duì)探究能否通過編程工程菌生活方式增強(qiáng)其腫瘤治療效果(圖5)。當(dāng)H017僅作為藥物遞送載體時(shí),高強(qiáng)度的近紅外光光照能夠使H017裂解釋放藥物,完成腫瘤治療。團(tuán)隊(duì)在20天的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi),通過8次注菌,有效抑制了腫瘤生長。接下來,研究團(tuán)隊(duì)通過光照程序?qū)?xì)菌的生活方式進(jìn)行控制,以實(shí)現(xiàn)對藥物累積和藥物釋放的持續(xù)控制。結(jié)果顯示,在對小鼠施加兩個(gè)循環(huán)周期的中等強(qiáng)度2天-高強(qiáng)度1天的近紅外光光照程序(M2-H1×2)后,小鼠腫瘤生長受到了抑制,而對照組無法抑制小鼠腫瘤生長。在更長周期的實(shí)驗(yàn)中(M2-H1×6),通過光照時(shí)間編程細(xì)菌生活方式進(jìn)行腫瘤治療使所有小鼠的腫瘤生長受到了抑制,其中30%小鼠的腫瘤完全消失,而對照組小鼠的腫瘤則持續(xù)生長。以上結(jié)果表明,編程細(xì)菌生活方式在腫瘤的長期治療過程中具有顯著優(yōu)勢,能夠在較少的注菌次數(shù)下獲得更好的腫瘤抑制效果。
該研究得到國家科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基因,中國科學(xué)院科研儀器設(shè)備研制項(xiàng)目、中國博士后科學(xué)基金,長安私人資本、深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院等多個(gè)項(xiàng)目的支持,并得到了合成生物重大科技基礎(chǔ)設(shè)施團(tuán)隊(duì)的大力協(xié)助。
圖1 用于編程細(xì)菌生活方式的基因線路的設(shè)計(jì)
圖2 通過層級性調(diào)節(jié)近紅外光的強(qiáng)度編程細(xì)菌生活方式
圖3 編程細(xì)菌“生物被膜-裂解”生活方式轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放
圖4 通過近紅外光操控實(shí)體瘤內(nèi)的細(xì)菌生活方式
圖5 編程瘤內(nèi)細(xì)菌生活方式促進(jìn)實(shí)體瘤消退
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