JIPB | 深圳先進(jìn)院合成所趙喬課題組發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸并非水楊酸合成的直接前體
水楊酸(Salicylic acid,SA)是植物體內(nèi)調(diào)節(jié)自身免疫的重要激素,參與植物的生物脅迫和非生物脅迫響應(yīng)。前期研究表明,植物中存在兩條水楊酸合成途徑:異分支酸合成酶(Isochorismate Synthase,ICS)途徑和苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Ammonia Lyase,PAL)途徑。在擬南芥中,病原菌或紫外誘導(dǎo)的水楊酸生物合成大約90%是通過ICS途徑合成,剩下的大約10%被認(rèn)為是通過PAL途徑合成。目前,ICS途徑中的基因已被一一解析,但是PAL途徑合成SA的相關(guān)組分尚未報道,擬南芥中SA是否來源于苯丙氨酸也缺乏確鑿的證據(jù)。
JIPB近日在線發(fā)表了中科院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院趙喬課題組題為“Salicylic acid biosynthesis is not from phenylalanine in Arabidopsis”(https://doi.org/10.1111/jip?b.13410)的“突破性報告”(Breakthrough Report)。該研究發(fā)現(xiàn),在擬南芥中,苯丙氨酸不能合成SA(2-Hydroxybenzoic acid,2-HBA),而是合成SA的同分異構(gòu)體4-羥基苯甲酸(4-Hydroxybenzoic acid,4-HBA),推翻了近30年來苯丙氨酸解氨酶途徑合成SA的假設(shè)。

圖.擬南芥中水楊酸合成的途徑
(A)苯丙氨酸合成SA的同分異構(gòu)體4-HBA;(B)PAL內(nèi)源活性增強不影響[13C6]-SA的合成;(C)IC途徑合成SA,PAL途徑合成SA的同分異構(gòu)體4-HBA
PAL途徑合成SA的證據(jù)來源于兩方面。一是通過[13C1]-或者[2H6,18O]-等同位素標(biāo)記前體飼喂實驗發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸可以經(jīng)反式肉桂酸、苯甲酸(Benzoic Acid,BA)進(jìn)而合成SA。但是,[13C1]-標(biāo)記實驗不能區(qū)分來源于同位素標(biāo)記前體的13C和天然的同位素峰,而2H-或者18O-標(biāo)記則可以通過溶液中氘原子的交換或羧酸氧在溶液中通過脫質(zhì)子作用的自發(fā)相互轉(zhuǎn)換而獲得。此外,生化證據(jù)表明BA可以生成SA,推測苯甲酸可能被BA2H(Benzoic Acid 2-Hydroxylase)羥基化產(chǎn)生SA,但在植物體內(nèi)編碼BA2H的基因尚未被發(fā)現(xiàn)。二是PAL基因可以影響植物與SA相關(guān)的系統(tǒng)獲得性抗性。但是PAL是苯丙烷途徑的第一個關(guān)鍵酶,可以影響許多其他防御相關(guān)的化合物的合成和代謝。
趙喬課題組首先通過穩(wěn)定同位素標(biāo)記苯環(huán)的[13C6]-Phe進(jìn)行示蹤實驗發(fā)現(xiàn),用[13C6]-Phe飼喂野生型擬南芥后,檢測不到[13C6]-SA的生成,取而代之的是SA的同分異構(gòu)體[13C6]-4-HBA。分別在SA缺陷突變體和SA積累突變體中進(jìn)行飼喂實驗,仍然檢測不到[13C6]-SA,也檢測不到SA的前體[13C6]-BA。但是,飼喂[13C6]-BA,可以檢測到[13C6]-SA的生成,說明苯丙氨酸在擬南芥中不能生成SA,而是合成其同分異構(gòu)體4-HBA;BA可以生成SA,可能是由于植物體內(nèi)其他基因的冗余功能。為了證實這一推論,本研究首先在利用丁香假單胞桿菌誘導(dǎo)SA的同時飼喂[13C6]-Phe,無論用Pst DC3000還是Pst DC3000(AvrRpm1)處理擬南芥,在SA誘導(dǎo)積累10-20倍含量的情況下,SA仍然不能被[13C6]-Phe標(biāo)記,只能檢測到[13C6]-4-HBA的生成。其次,由于KFB(Kelch domain-containing F-box)蛋白可以影響擬南芥內(nèi)源PAL蛋白的穩(wěn)定性,該研究構(gòu)建了在kfb突變體背景下的PAL基因的過表達(dá)植株。PAL內(nèi)源蛋白水平提高后,其活性得到了明顯提升,4-HBA的含量也得到了相應(yīng)的積累。在PAL過表達(dá)植株中飼喂[13C6]-Phe,仍然只檢測到[13C6]-4-HBA的生成。因此該研究揭示了擬南芥中SA的合成并不來源于苯丙氨酸,推翻了關(guān)于苯丙氨酸解氨酶途徑合成SA的假設(shè),也為解析SA新的合成途徑,完善SA的生物合成以及為作物抗病育種指明了新的方向。
趙喬課題組近年來通過遺傳分析、代謝組學(xué)分析和生物化學(xué)分析等手段,在苯丙烷途徑的合成、代謝以及調(diào)控等研究中取得了一系列進(jìn)展,揭示了擬南芥苯丙氨酸衍生物類黃酮合成途徑調(diào)控的新機(jī)制(Wang et al., 2020),木質(zhì)素合成與其前體苯丙氨酸合成共調(diào)控的分子機(jī)制(Geng et al., 2020),并以解析苯丙烷合成通路中的UGT72E家族功能為例,開發(fā)了特異針對糖基化合物的靶向代謝組和同位素標(biāo)記前體化合物示蹤相結(jié)合的新方法(Wu et al., 2022)。這篇論文進(jìn)一步通過穩(wěn)定同位素標(biāo)記前體化合物示蹤的方法,推翻了擬南芥可以通過PAL途徑合成SA的假設(shè)。
趙喬課題組助理研究員吳杰為該論文的第一作者,趙喬研究員為通訊作者。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)系朱文濤副教授也參與并指導(dǎo)了該項研究工作。該研究得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、廣東省合成基因組學(xué)重點實驗室和深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院等的支持。
參考文獻(xiàn):
1. Wang, X., Wu, J., Guan, M., Zhao, C., Geng, P., and Zhao, Q. (2020). Arabidopsis MYB4 plays dual roles in flavonoid biosynthesis. Plant J. 101: 637-652.
2. Geng, P., Zhang, S., Liu, J., Zhao, C., Wu, J., Cao, Y., Fu, C., Han, X., He, H., and Zhao, Q. (2020). MYB20, MYB42, MYB43 and MYB85 regulate phenylalanine and lignin biosynthesis during secondary cell wall formation. Plant Physiol. 182: 1272-1283.
3. Wu, J., Zhu, W., Shan, X., Liu, J., Zhao, L., and Zhao, Q. (2022). Glycosides specific metabolomics combined with precursor isotopic labeling for characterizating plant glycosyltransferases. Mol. Plant 15: 1428-1443.
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