ACS Synthetic Biology | 深圳先進(jìn)院合成所司同課題組對羊毛硫肽衍生物文庫的自動(dòng)化構(gòu)建和篩選
11月15日,中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院司同課題組在國際學(xué)術(shù)期刊ACS Synthetic Biology發(fā)表研究論文“Robotic Construction and Screening of Lanthipeptide Variant Libraries in Escherichia coli”。作者依托深圳合成生物研究重大科技基礎(chǔ)設(shè)施(簡稱“大設(shè)施”),開發(fā)了羊毛硫肽(lanthipeptide)衍生物文庫在大腸桿菌底盤中的自動(dòng)化構(gòu)建和篩選技術(shù),系統(tǒng)性解析了雙組份羊毛硫肽haloduracin中α多肽的構(gòu)-效關(guān)系,篩選得到K13V/A15R組合突變顯著提升抑菌活性。實(shí)習(xí)研究員郭二鵬為文章的第一作者,助理研究員洪志來博士為文章的共同通訊作者。

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全文鏈接:https://doi.org/10.1021/acssynbio.2c00344
核糖體合成后翻譯肽(Ribosomally synthesized and posttranslationally modified peptide,RiPPs)是由核糖體合成,經(jīng)翻譯后修飾酶修飾獲得具有特殊結(jié)構(gòu)和活性的天然產(chǎn)物。羊毛硫肽是一大類RiPP,其特點(diǎn)是分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)或多個(gè)硫醚鍵連接的羊毛硫氨酸(Lan)和/或甲基化羊毛硫氨酸(MeLan)。在羊毛硫肽的生物合成過程中,前體肽基因先經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯形成前體肽(Precursor peptide),然后被羊毛硫肽合成酶識別并在核心肽(Core peptide)中引入脫水和環(huán)化修飾。最終,前導(dǎo)肽被蛋白酶或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白酶結(jié)構(gòu)域移除,釋放出具有功能活性的成熟羊毛硫肽。羊毛硫肽具有廣泛的生物活性(如抗細(xì)菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等)和應(yīng)用價(jià)值。
作者在先前研究中,實(shí)現(xiàn)了多肽底物、合成酶、蛋白酶重組表達(dá)的時(shí)空調(diào)控,建立了羊毛硫肽及其衍生物在大腸桿菌中異源合成的通用方法。然而,該方法依賴手工操作,限制了工程改造的篩選通量和一致性。在本研究中,作者依托合成生物“大設(shè)施”(Biofoundry),針對羊毛硫肽衍生物庫的構(gòu)建和篩選過程建立了自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)流程和方法,包括前體基因突變文庫構(gòu)建、大腸桿菌轉(zhuǎn)化、克隆挑取、液體培養(yǎng)與重組表達(dá)、MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定、瓊脂抑菌實(shí)驗(yàn)等不同環(huán)節(jié),可以在兩周內(nèi)快速合成和篩選大量羊毛硫肽衍生物(圖1).
首先,作者驗(yàn)證了基于大腸桿菌自裂解系統(tǒng)能夠在96孔板中產(chǎn)生成熟的haloduracin α多肽。隨后,基于“大設(shè)施”的自動(dòng)化平臺,作者針對不參與成環(huán)的殘基在前體基因中引入NNK簡并密碼子,成功構(gòu)建定點(diǎn)飽和突變文庫(Site-saturation mutagenesis,SSM)并獲得了全部380個(gè)突變株。作者基于瓊脂抑菌實(shí)驗(yàn),快速獲得了序列-活性數(shù)據(jù),并結(jié)合進(jìn)化分析、文獻(xiàn)報(bào)道分析了關(guān)鍵位點(diǎn)和突變(圖2)。根據(jù)瓊脂抑菌篩選結(jié)果,作者挑選了表觀活性優(yōu)于野生型的衍生物分子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵和分離純化,但并未觀察到比活(specific activity)指標(biāo)的提升,表明基于細(xì)胞裂解液和瓊脂抑菌圈的篩選方法具有局限,推測結(jié)果可能被多種因素影響(如翻譯后修飾、產(chǎn)量、瓊脂中的穩(wěn)定性和擴(kuò)散能力等)?;谧詣?dòng)化平臺,作者進(jìn)一步開展了MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定和GFP融合表達(dá)分析,對衍生物的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)量進(jìn)行分析。
隨后,作者進(jìn)一步選擇A環(huán)中Lys13、Ala15和Tyr16進(jìn)行組合突變,這些位點(diǎn)對氨基酸突變具有高耐受性,且在同源序列中具有進(jìn)化多樣性。作者使用編碼12種氨基酸的NDT簡并密碼子構(gòu)建組合突變文庫,通過DNA測序從4800個(gè)隨機(jī)菌落中篩選得到1373個(gè)獨(dú)特的三位點(diǎn)突變株(占理論文庫容量12 × 12 × 12 = 1728的79.4%),通過瓊脂抑菌實(shí)驗(yàn)獲得序列功能關(guān)系(圖3),并最終篩選得到Lys13Val-Ala15Arg組合突變可以顯著降低對L. lactis指示菌的最小抑菌濃度。
小結(jié):依托深圳合成生物“大設(shè)施”,團(tuán)隊(duì)成功開發(fā)了羊毛硫肽天然產(chǎn)物衍生物文庫的自動(dòng)化構(gòu)建和篩選方法。該自動(dòng)化流程有望在未來加速大規(guī)模基因組挖掘發(fā)現(xiàn)新活性骨架、規(guī)模化解析構(gòu)-效關(guān)系用于機(jī)理研究、數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)方法在藥物分子開發(fā)中的應(yīng)用。
該成果得到了科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國自然面上和青年基金、南方海洋廣東省實(shí)驗(yàn)室(廣州)深圳分部、華大研究院開放基金和深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院等項(xiàng)目的支持。

圖1:A)自動(dòng)化功能島布局,B)羊毛硫肽突變文庫自動(dòng)化構(gòu)建和篩選流程

圖2:A)halα單點(diǎn)飽和突變構(gòu)效關(guān)系;
B)前體肽基因進(jìn)化保守性分析;C)halα和Ltnα功能結(jié)構(gòu)域比較

圖3:halα- Lys13/ Ala15/ Tyr16三位點(diǎn)NDT組合突變構(gòu)效關(guān)系
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