Angew | 光能入胞:深圳先進(jìn)院構(gòu)建核黃素-微生物雜合體系實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)NADPH定向再生
自然界中,植物通過(guò)光合作用將太陽(yáng)能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,支撐地球生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)。受此啟發(fā),人工光合作用希望借助光敏材料和微生物,把太陽(yáng)能轉(zhuǎn)化為可儲(chǔ)存、可利用的化學(xué)品,為綠色制造和碳資源利用提供新路徑。
然而,現(xiàn)有半人工光合系統(tǒng)仍面臨關(guān)鍵瓶頸。光敏材料雖然能夠吸收光并產(chǎn)生電子,但這些電子進(jìn)入細(xì)胞后往往缺少明確方向,可能被還原型輔酶I(NADH)、還原型輔酶II(NADPH)或其他氧化還原過(guò)程分散消耗,導(dǎo)致能量利用效率和產(chǎn)物合成效率受限。因此,如何讓光生電子精準(zhǔn)進(jìn)入目標(biāo)代謝過(guò)程,成為提升半人工光合系統(tǒng)性能的核心問(wèn)題。
針對(duì)此挑戰(zhàn),研究團(tuán)隊(duì)提出了一種基于小分子光敏劑核黃素的細(xì)胞內(nèi)還原力定向補(bǔ)給策略?;谶@一思路,中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院定量合成生物學(xué)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/合成生物學(xué)研究所王博研究員團(tuán)隊(duì)與清華大學(xué)蔡中華教授團(tuán)隊(duì)合作,于近日在《德國(guó)應(yīng)用化學(xué)》(Angewandte Chemie International Edition)發(fā)表了題為"Defining Rational Photoelectron Routing for Targeted Intracellular Energy Transfer"的論文。該研究利用核黃素良好的生物相容性、可見(jiàn)光響應(yīng)能力和跨膜擴(kuò)散能力,將光生電子更有選擇地導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)NADPH再生過(guò)程,從而促進(jìn)NADPH依賴(lài)型產(chǎn)物合成。該工作從理論計(jì)算、體外光譜驗(yàn)證、細(xì)胞內(nèi)還原力檢測(cè)、轉(zhuǎn)錄組分析、反向工程驗(yàn)證以及跨物種應(yīng)用等多個(gè)層面,建立了光生電子定向進(jìn)入特定細(xì)胞還原力的研究框架,為半人工光合系統(tǒng)從經(jīng)驗(yàn)組合走向機(jī)制指導(dǎo)設(shè)計(jì)提供了新思路。
傳統(tǒng)半人工光合體系多關(guān)注光敏材料的捕光和產(chǎn)電子能力,但對(duì)光生電子進(jìn)入細(xì)胞后的去向缺乏精準(zhǔn)調(diào)控。細(xì)胞內(nèi)NADH和NADPH功能不同——NADPH主要支撐氨基酸、有機(jī)酸和糖醇等還原型產(chǎn)物合成,但其胞內(nèi)含量較低,再生能力常成為高效生物制造的限制因素。因此,如何將外源光能更精準(zhǔn)地轉(zhuǎn)化為NADPH,是提升半人工光合系統(tǒng)效率的重要突破口。
圍繞這一問(wèn)題,研究團(tuán)隊(duì)選擇天然小分子核黃素作為光敏劑。核黃素具有良好的生物相容性和光響應(yīng)能力,且能夠在細(xì)胞內(nèi)外移動(dòng),因而更容易接近胞內(nèi)氧化還原環(huán)境。研究團(tuán)隊(duì)提出,光激發(fā)后的核黃素可能借助分子結(jié)構(gòu)和能量匹配優(yōu)勢(shì),更傾向于支持氧化性輔酶II(NADP?)向還原型輔酶II(NADPH)轉(zhuǎn)化。
為驗(yàn)證上述設(shè)想,研究團(tuán)隊(duì)首先通過(guò)理論計(jì)算發(fā)現(xiàn),相比氧化性輔酶I(NAD?),NADP?在能級(jí)匹配、電子接受能力和結(jié)合能等方面更有利于接受光激發(fā)核黃素提供的電子。飛秒瞬態(tài)吸收光譜也顯示,核黃素與NADP?共存時(shí)產(chǎn)生更強(qiáng)、更持久的動(dòng)力學(xué)信號(hào),說(shuō)明二者更容易形成有利于電子轉(zhuǎn)移的狀態(tài)。
隨后,熒光淬滅、光電流、等溫滴定量熱和甲基紫精還原等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明,核黃素可在可見(jiàn)光下被有效激發(fā),并對(duì)NADP?表現(xiàn)出更強(qiáng)的結(jié)合和電子轉(zhuǎn)移偏好。
隨后,研究團(tuán)隊(duì)以釀酒酵母為模型構(gòu)建核黃素-酵母生物雜化體系。光電流、穩(wěn)態(tài)熒光和時(shí)間分辨熒光結(jié)果顯示,生物雜化體系中核黃素?zé)晒鈴?qiáng)度明顯降低,激發(fā)態(tài)壽命由4.89 ns縮短至3.13 ns,說(shuō)明光激發(fā)核黃素產(chǎn)生的電子可被細(xì)胞內(nèi)氧化還原體系快速利用。
進(jìn)一步的細(xì)胞裂解液競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)顯示,在NAD?和NADP?同時(shí)存在時(shí),光照下核黃素更顯著促進(jìn)NADPH積累,其再生速率為NADH的3.76倍。無(wú)細(xì)胞酶環(huán)境中未觀察到明顯NADPH再生,說(shuō)明該過(guò)程依賴(lài)NADP?相關(guān)氧化還原酶的參與。
在酵母細(xì)胞中,核黃素和光照共同作用顯著提高NADPH/NADP?比值,而NADH/NAD?比值基本不變。以木糖醇為NADPH依賴(lài)型產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證,光照24小時(shí)后產(chǎn)量達(dá)到約1.59 g/L,表明核黃素介導(dǎo)的光生電子可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為實(shí)際生物合成能力。
為排除光脅迫和內(nèi)源黃素代謝背景的影響,研究團(tuán)隊(duì)檢測(cè)了活性氧水平、細(xì)胞活力,并比較了核黃素、黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的作用。結(jié)果顯示,光照生物雜化組未出現(xiàn)明顯氧化脅迫或細(xì)胞損傷,且外源核黃素對(duì)木糖醇合成的促進(jìn)作用最強(qiáng),說(shuō)明NADPH升高主要來(lái)自核黃素介導(dǎo)的光生電子輸入。
轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)一步顯示,光照生物雜化組中與核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)、電子傳遞和NADPH再生相關(guān)的基因明顯上調(diào),而關(guān)鍵戊糖磷酸途徑(PPP)相關(guān)基因變化不明顯。使用PPP關(guān)鍵途徑葡萄糖-6-磷酸脫氫酶?(G6PDH)抑制劑后,NADPH/NADP?比值和木糖醇產(chǎn)量仍保持較高水平,說(shuō)明該過(guò)程不主要依賴(lài)傳統(tǒng)氧化型PPP。進(jìn)一步的反向工程驗(yàn)證表明,線粒體物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)(YHM2)、氧化還原調(diào)控(MXR2)和鐵硫簇(YAH1)相關(guān)過(guò)程,均能進(jìn)一步影響NADPH再生和木糖醇合成,其中YHM2的影響最顯著,是核黃素介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)電子利用的重要參與因子。
為驗(yàn)證該策略的適用范圍,研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步將體系拓展到不同微生物底盤(pán)和產(chǎn)物合成過(guò)程。在NADPH依賴(lài)型體系中,核黃素光照處理明顯提高了工程大腸桿菌的賴(lài)氨酸產(chǎn)量和產(chǎn)乙酸菌(Sporomusa ovata)的乙酸產(chǎn)量。相反,在NADH依賴(lài)型的工程酵母乙酸轉(zhuǎn)葡萄糖體系和野生型大腸桿菌產(chǎn)氫體系中,并未觀察到類(lèi)似增強(qiáng)效果。該結(jié)果說(shuō)明,核黃素介導(dǎo)的光生電子輸入并不是普遍增強(qiáng)所有還原型代謝,而是更偏向支持NADPH依賴(lài)型生物合成。
總體而言,本研究提出并驗(yàn)證了一種利用核黃素定向補(bǔ)給細(xì)胞NADPH的光生電子調(diào)控策略。該工作不僅證明了光生電子能夠進(jìn)入細(xì)胞,更進(jìn)一步回答了電子進(jìn)入細(xì)胞后如何被精準(zhǔn)利用的問(wèn)題,為半人工光合系統(tǒng)從材料驅(qū)動(dòng)走向機(jī)制指導(dǎo)設(shè)計(jì)提供了新思路。未來(lái),該策略有望與光敏分子設(shè)計(jì)和代謝工程進(jìn)一步結(jié)合,用于更多NADPH依賴(lài)型高價(jià)值化合物的綠色制造。
本研究由中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院定量合成生物學(xué)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/合成生物學(xué)研究所王博研究員、肖可蒙副研究員、曾翠平助理研究員與清華大學(xué)蔡中華教授共同通訊完成。清華大學(xué)/中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院聯(lián)合培養(yǎng)博士生王浩為本文第一作者,深圳先進(jìn)院為主要完成單位之一。研究獲得國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、深圳市科技計(jì)劃、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金以及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院等項(xiàng)目資助。

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圖2.?核黃素與NADP?之間的分子識(shí)別和光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移驗(yàn)證

圖3.?核黃素光激發(fā)促進(jìn)酵母細(xì)胞內(nèi)NADPH再生和木糖醇合成

圖4.?轉(zhuǎn)錄組和反向工程揭示核黃素介導(dǎo)NADPH再生的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制

圖5.?跨物種驗(yàn)證核黃素光生電子輸入更偏向NADPH依賴(lài)型合成代謝
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