Sci Transl Med封面文章?| 深圳先進(jìn)院報道化藥協(xié)同指揮核酸藥的“小王子”系統(tǒng):雙重開關(guān)實(shí)現(xiàn)CRISPR體內(nèi)原位“主動可控”
時間控制對于CRISPR核酸藥物的安全成藥具有核心意義:CRISPR在體內(nèi)持續(xù)活躍時間過長,可能增加非預(yù)期基因組改變的風(fēng)險(如脫靶編輯與染色體重排);而DNA編輯一旦完成,通常穩(wěn)定存在,無需CRISPR持續(xù)活躍。
當(dāng)前多個進(jìn)入臨床試驗(yàn)后期的CRISPR技術(shù)(如首個獲批藥物Casgevy)在時間控制上主要依賴RNA或蛋白組分的自然降解這一“被動方式”。然而,自然降解并不等同于主動控制。主動控制意味著可通過外部信號決定編輯的啟動與終止,從而有望進(jìn)一步提升精準(zhǔn)度與安全性,并拓展CRISPR技術(shù)的應(yīng)用范圍。
實(shí)現(xiàn)主動控制面臨顯著挑戰(zhàn)。CRISPR核酸酶起源于微生物防御系統(tǒng),具有高效催化活性;但治療性基因編輯要求其僅在特定細(xì)胞、特定基因組位點(diǎn)、特定時間窗口內(nèi)發(fā)揮作用。在多種外部觸發(fā)方式中,合成且正交的小分子藥物提供了一種較為可行的解決辦法。“正交”指編輯系統(tǒng)僅受外源性小分子藥物調(diào)控,而不受體內(nèi)內(nèi)源或者環(huán)境外源因素干擾。小分子藥物具有組織分布廣泛、可跨越血腦屏障、調(diào)控動態(tài)可逆等優(yōu)勢,因此非常適于作為體內(nèi)基因編輯的外源開關(guān)。
王宇團(tuán)隊(duì)早在2018年曾報道初代藥控系統(tǒng)HIT(Hybrid Inducible Technologies)系列。該系統(tǒng)為首個采用蛋白核定位調(diào)控策略控制CRISPR的技術(shù)之一,利用化學(xué)藥物控制核酸酶能否進(jìn)入細(xì)胞核,從而調(diào)控CRISPR是否能夠接觸位于細(xì)胞核內(nèi)的基因組靶點(diǎn),實(shí)現(xiàn)藥物調(diào)控(Nucleic Acids Res., 2018;?Mol.Ther. Nucleic Acids, 2018)(2, 3)。然而,HIT系統(tǒng)主要在細(xì)胞層面進(jìn)行短時間測試,距離更高要求的體內(nèi)驗(yàn)證尤其是治療性應(yīng)用,仍存在明顯差距。
5月27日,中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院定量合成生物學(xué)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/合成生物學(xué)研究所王宇團(tuán)隊(duì)在多年持續(xù)鉆研的基礎(chǔ)上,聯(lián)合復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科??漆t(yī)院洪佳旭團(tuán)隊(duì),在Science Translational Medicine以封面論文的形式報道了進(jìn)一步升級的小分子可控CRISPR系統(tǒng),在推動CRISPR核酸藥物向更嚴(yán)謹(jǐn)、精準(zhǔn)、主動可控的方向發(fā)展邁出了關(guān)鍵一步(4)。
研究人員開發(fā)了兩類系統(tǒng),分別命名為PRINCE和Little Prince。PRINCE的全稱是nuclease?proteins and guide?RNAs both?inducible for programmable?nucleases under?control?effectively,其含義為“核酸酶蛋白和向?qū)NA均可被誘導(dǎo),從而有效控制可編程核酸酶”。該名稱直接體現(xiàn)了系統(tǒng)的核心設(shè)計(jì):并非僅控制單一組分,而是協(xié)同控制核酸酶蛋白與向?qū)NA。Little Prince則是面向體內(nèi)遞送的緊湊版本;作者作為《小王子》的愛好者,借此迷你系統(tǒng)的命名向這一跨越時空的經(jīng)典作品致敬,并期望通過對編輯系統(tǒng)時間維度的更優(yōu)掌控,為患者(尤其是兒童罕見病患者)提供更加精準(zhǔn)、安全的基因治療選擇(5)。
在這項(xiàng)工作之前,包括HIT在內(nèi)的誘導(dǎo)型CRISPR系統(tǒng)通常僅控制編輯蛋白,或僅控制向?qū)NA。王宇團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn),單獨(dú)控制其中一個組分尚不足以實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格調(diào)控,尤其在編輯系統(tǒng)長期穩(wěn)定表達(dá)時,容易產(chǎn)生背景活性。
因此,PRINCE和Little Prince首次采用“雙層協(xié)同控制”:第一層控制核酸酶蛋白,通過小分子響應(yīng)的調(diào)控模塊,例如核定位調(diào)控或蛋白穩(wěn)定性調(diào)控,調(diào)節(jié)核酸酶的功能狀態(tài);第二層控制向?qū)NA,例如通過多西環(huán)素響應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)向?qū)NA的產(chǎn)生。此類協(xié)同調(diào)控有助于在編輯效率與調(diào)控嚴(yán)密性之間取得平衡:既保持有效的靶向編輯活性,又盡量降低無誘導(dǎo)劑條件下的背景編輯與脫靶風(fēng)險。
在人源細(xì)胞中,PRINCE構(gòu)件穩(wěn)定整合到基因組后,即使經(jīng)過長期培養(yǎng),系統(tǒng)仍能保持嚴(yán)格控制,無誘導(dǎo)劑條件下,細(xì)胞僅顯示出極低的背景活性;同時,在連續(xù)兩年的培養(yǎng)過程中,僅需短暫暴露于藥物誘導(dǎo)劑24小時,即可有效激活編輯。全基因組分析進(jìn)一步顯示,與持續(xù)表達(dá)型CRISPR系統(tǒng)相比,PRINCE產(chǎn)生的脫靶位點(diǎn)顯著減少?;谶@一設(shè)計(jì)原則,研究團(tuán)隊(duì)將其擴(kuò)展至先導(dǎo)編輯,通過協(xié)同調(diào)控系統(tǒng)中的切口酶與向?qū)NA,實(shí)現(xiàn)了先導(dǎo)編輯的嚴(yán)格主動控制。
為使系統(tǒng)更適于體內(nèi)遞送,研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步創(chuàng)建了Little Prince。這一基于小型核酸酶構(gòu)建的緊湊版本,可以裝入單個腺相關(guān)病毒載體(AAV)中。
在高膽固醇血癥人源化小鼠模型中,研究人員使用AAV8遞送Little Prince,并在肝臟中靶向人源PCSK9。藥物誘導(dǎo)后,系統(tǒng)在體內(nèi)原位產(chǎn)生了強(qiáng)效編輯;而未接受藥物誘導(dǎo)的小鼠,其背景編輯水平與陰性對照(包括無編輯器對照)相當(dāng)。功能檢測結(jié)果顯示,血清總膽固醇與低密度脂蛋白膽固醇大約下降了一半。
在復(fù)旦大學(xué)洪佳旭團(tuán)隊(duì)的合作支持下,研究人員還在人源化新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性小鼠模型中測試了Little Prince。該系統(tǒng)靶向視網(wǎng)膜中的人源VEGFA。藥物誘導(dǎo)顯著降低了病理性血管滲漏與病灶面積,且視網(wǎng)膜電圖檢測顯示視網(wǎng)膜功能得到改善。
總體而言,在細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)中,與持續(xù)表達(dá)型編輯器相比,Little Prince顯示出更少的脫靶位點(diǎn)及更低的脫靶編輯頻率。上述結(jié)果支持一個重要結(jié)論:嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹鲃訒r間控制可以在保留具有治療意義的靶向編輯活性的同時,提高治療性基因編輯的精確性與基因組安全性,有望優(yōu)化編輯技術(shù)成藥的有效性/安全性平衡。
在此基礎(chǔ)上,研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步評估了該策略的長期安全性,并拓展至堿基編輯、先導(dǎo)編輯等更多編輯器以及疾病譜。在有效性與安全性得到充分驗(yàn)證后,該策略將推進(jìn)至臨床轉(zhuǎn)化(未發(fā)表結(jié)果)。
該論文在審稿過程中得到了審稿人與期刊編輯的高度評價。在隨論文一同發(fā)表的總結(jié)中,編輯指出,控制基因編輯的持續(xù)時長有望提升安全性,然而精準(zhǔn)的時間控制是一大挑戰(zhàn),該工作成功解決了這一問題,并顯示出臨床轉(zhuǎn)化潛力。
這項(xiàng)研究也體現(xiàn)了重要的領(lǐng)域交叉理念:將小分子藥物這一“傳統(tǒng)”藥物形式與CRISPR這一“現(xiàn)代”基因治療藥物形式相結(jié)合。小分子藥物雖然歷史悠久,但其組織分布、給藥調(diào)控和可逆性等經(jīng)典優(yōu)勢,恰好可為基因編輯技術(shù)提供所需的時間控制能力。沒有過時的領(lǐng)域,只有不可替代的經(jīng)典優(yōu)勢與價值。
中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院定量合成生物學(xué)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/合成生物學(xué)研究所助理研究員張菊、深圳大學(xué)博士后陳麗、復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉??漆t(yī)院朱星宇為該論文的共同第一作者。中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院定量合成生物學(xué)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/合成生物學(xué)研究所研究員王宇和復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉??漆t(yī)院洪佳旭為共同通訊作者。周行濤、蔡雨珊、韋詩弦、周旭嬌、石詠詩、劉傳承、黃成思、畢勝光、吳鳳梅為參與作者,對本項(xiàng)工作做出重要貢獻(xiàn)。本項(xiàng)工作得到了國家自然科學(xué)基金、重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院以及深圳市基因組操縱及生物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等的大力支持。

期刊封面
(封面設(shè)計(jì):王宇/洪佳旭團(tuán)隊(duì))

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圖1. Little Prince靶向肝臟原位可控編輯,逆轉(zhuǎn)高血脂

圖2. Little Prince靶向眼底原位可控編輯,逆轉(zhuǎn)脈絡(luò)膜新生血管的血管滲漏(模擬濕性黃斑變性)

圖3. Little Prince相對于持續(xù)活躍的組成型,顯著提高體內(nèi)原位的基因組靶向精準(zhǔn)性
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