Nat Commun|解析阿卡波糖水解酶Apg的催化機制,抗降解藥物設計迎來新突破
阿卡波糖是治療2型糖尿病的一線藥物,但其療效常被腸道細菌中的“阿卡波糖殺手”——阿卡波糖糖苷水解酶(Apg)破壞。近日,中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所客座研究員/南京師范大學教授周佳海團隊及其團隊副研究員古陽,聯(lián)合西北農(nóng)林科技大學教授張繼文團隊等,在Nature Communications發(fā)表題為“Molecular insights of acarbose metabolization catalyzed by acarbose-preferred glucosidase”的最新研究成果,利用X射線晶體學、計算模擬和生化實驗結合,深入解析了Apg水解阿卡波糖的精細分子機制(圖1),為設計新一代抗降解、更高效的降糖藥物提供了關鍵的結構藍圖。
一、阿卡波糖的困境:個體差異與耐藥性
阿卡波糖作為一種“偽四糖”,主要通過抑制腸道α-葡萄糖苷酶延緩碳水化合物吸收來降糖。它具有全身副作用少的優(yōu)點,但臨床應用中存在顯著的個體療效差異和長期用藥后的耐藥性問題。近年中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心姜衛(wèi)紅團隊與合作者研究發(fā)現(xiàn)(Nat. Metab., 2023, s42255-023-00796-w),克雷伯氏菌屬(K. grimontii TD1)中的Apg酶是導致阿卡波糖失效的關鍵“元兇”。它能高效降解阿卡波糖為acarviosine-glucose(M1)和acarviosine(M2),從而破壞其藥效(圖2)。然而,由于缺乏酶-底物/產(chǎn)物復合物的精確結構信息,導致該酶動態(tài)催化過程的分子機制仍不明晰,限制了糖尿病治療的優(yōu)化及抗糖尿病藥開發(fā)。解析Apg獨特的催化機制將有助于抗糖尿病藥物的設計。
二、 鎖定“殺手”:Apg的結構與特性
Apg屬于糖苷水解酶家族13_21 (GH13_21),通常負責水解α-1,4-O-糖苷鍵。但其獨特之處在于能有效水解結構復雜的阿卡波糖。研究解析了Apg的高分辨率晶體結構(圖3):(1)Apg在溶液中以同源二聚體形式存在,單體間通過N端結構域和催化結構域呈頭尾排列。(2)催化結構域采用經(jīng)典的TIM桶折疊,活性位點是位于TIM桶頂部的一個突出表面凹槽,凹槽底部有一個絕對保守的催化三聯(lián)體(Asp-Glu-Asp)。(3)與其他淀粉酶(如MaIZ, MaIS)相比,Apg的活性口袋裂隙更窄(7.9 ?),能緊密結合阿卡波糖,計算也顯示其對阿卡波糖的結合親和力更高。(4)結合生化實驗、晶體結構和計算分析,發(fā)現(xiàn)兩個關鍵的柔性環(huán)(loop A和loop B)不僅影響底物結合還決定其催化能力。
三、 重要發(fā)現(xiàn):Apg催化機制的關鍵角色
通過分析Apg與阿卡波糖及其水解產(chǎn)物(M1, M2)的復合物晶體結構,結合定點突變和計算模擬(QM/MM, MD)(圖4),研究揭示了催化機制的核心要素,并推翻了之前的假設:
四、 水解路徑揭秘:兩步反應,一步限速
阿卡波糖被Apg水解的最終產(chǎn)物是二環(huán)的M2。關于M2是如何產(chǎn)生的,存在疑問:(1)是阿卡波糖直接一步水解成M2和麥芽糖?計算模擬(QM/MM)顯示此路徑能壘極高(36.9 kcal/mol),且實驗中未檢測到麥芽糖副產(chǎn)物,排除了此可能性。(2)還是分步水解?晶體實驗觀察到將Apg與中間產(chǎn)物M1孵育可生成M2。結合動力學和熱力學分析發(fā)現(xiàn),Apg對阿卡波糖的親和力遠高于對M1。進一步的自由能計算發(fā)現(xiàn),Apg-阿卡波糖復合物的結合自由能(-20.5 kcal/mol)顯著低于Apg-M1(-13.8 kcal/mol)。QM/MM計算顯示,從M1水解到M2的能壘(19.7 kcal/mol)高于從阿卡波糖水解到M1的能壘(17.1 kcal/mol)。因此,阿卡波糖被Apg水解是一個明確的兩步過程:第一步為阿卡波糖→M1+葡萄糖(相對較快),第二步為M1→M2+葡萄糖(此步是限速步驟,較慢)。
五、耐藥類似物的啟示:結構差異決定命運
研究還利用解析的Apg結構,對已知對Apg具有抗性的阿卡波糖類似物——acarstatins A和acarstatins B進行了計算分析。分子動力學模擬顯示,它們也能結合在Apg活性腔內。但關鍵差異在于,它們分子中水解位點C1原子與親核試劑D448 OD2的距離比阿卡波糖中的距離更遠,使得D448難以有效攻擊其糖苷鍵。進一步的QM/MM計算證實,水解acarstatinsA/B的活化能壘高于阿卡波糖。這為設計抗Apg降解的新藥提供了直接線索:通過修飾改變底物關鍵原子與催化殘基(特別是D448)的空間距離或相互作用。
綜上,本文通過晶體結構解析、生化實驗以及理論計算對Apg催化阿卡波糖水解反應機理進行了深入研究。揭示了Apg水解阿卡波糖的真實分子機制(D448為親核試劑,E373/R334為質子供體,D336為穩(wěn)定劑,兩步水解且第二步限速),為糖尿病藥物的設計與開發(fā)提供結構方面的見解,包括延長糖鏈的長度以增強其對抗Apg水解的能力,或者對阿卡波糖的結構部分進行選擇性修飾以降低其結合親和力?;谝陨辖Y構見解,對下一代阿卡波糖類似物的研究正在進行中。
本文的通訊作者為中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所客座研究員/南京師范大學教授周佳海、團隊副研究員古陽,以及西北農(nóng)林科技大學教授張繼文。第一作者為中國科學院深圳先進技術研究院與西北農(nóng)林科技大學聯(lián)合培養(yǎng)已畢業(yè)博士研究生黃嘉詠。中國科學院深圳先進技術研究院助理研究員諶莊琳博士對于理論計算部分做出了重要貢獻。感謝中國科學院深圳先進技術研究院助理研究員王蘭騰博士在晶體解析方面的付出。感謝中國科學院深圳先進技術研究院與中國農(nóng)業(yè)大學聯(lián)合培養(yǎng)已畢業(yè)碩士研究生肖小云的付出。該工作受到廣東省科技計劃項目、國家自然科學基金項目、深圳市科技計劃項目以及深圳合成生物學創(chuàng)新研究院等項目的資助。衷心感謝上海光源和國家蛋白質科學研究(上海)設施生物大分子晶體學線站BL18U1、BL19U1工作人員在數(shù)據(jù)收集方面的大力協(xié)助!

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原文鏈接:https://doi.org/10.1038/s41467-025-62855-y

圖1.?Apg催化水解阿卡波糖的機制

圖2.?由Apg介導的阿卡波糖降解途徑

圖3. Apg的總體結構示意圖

圖4 Apg?的復合物結構及突變酶活分析。(A)Apg?活性位點腔內底物阿卡波糖的示意圖。(B)Apg(D448A)-阿卡波糖的復合物結構(PDB ID:9IVZ)。(C)Apg(D336A)-M1的復合物結構(PDB ID:9IZE)。(D)Apg(D336A)-M2的復合物結構(PDB ID:9IZO)。(E)Apg(D448A)-阿卡波糖復合物(PDB ID:9IVZ)(殘基為粉色)與突變體?Apg(D448A)(PDB?編號:9IXH)的結構疊加(殘基為白色)。(F)Apg?活性位點上殘基的誘變實驗。

圖5. Apg催化阿卡波糖水解反應的兩步過程

圖6. Apg-acarstatins?A/B復合物的距離特征分析
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