PNAS | MiniCasUltra:“加強(qiáng)版迷你”基因編輯器
腺相關(guān)病毒(AAV)載體因其低免疫原性與組織靶向性,是體內(nèi)基因治療的標(biāo)準(zhǔn)遞送系統(tǒng)(1)。然而,傳統(tǒng)CRISPR核酸酶(如SpCas9,>1000 aa)的尺寸接近AAV包裝極限(≈4.7 kb),使得AAV載體難以同時(shí)容納該核酸酶、sgRNA或更多的調(diào)控元件或者效應(yīng)元件(2,3)。因此尺寸更小的核酸酶是基因編輯領(lǐng)域孜孜不倦追求的重要目標(biāo)。然而,近年來發(fā)現(xiàn)的緊湊型核酸酶(如Cas12f家族,400-700 aa)雖具尺寸優(yōu)勢(shì)(4,5),編輯效率卻顯著低于Cas9/Cas12a,且嚴(yán)格的原間隔序列鄰近基序(PAM)要求(如Un1Cas12f1需5-TTTR)大幅限制基因組靶向范圍。
8月5日,中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所王宇團(tuán)隊(duì)聯(lián)合復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院洪佳旭團(tuán)隊(duì),在國際學(xué)術(shù)期刊Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS)?發(fā)表了題目為“Engineered Un1Cas12f1 with boosted gene-editing activity and expanded genomic coverage”的研究。本研究通過結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的理性設(shè)計(jì)改造Un1Cas12f1,分析此前發(fā)表的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(PDB: 7L49)鎖定DNA結(jié)合與切割關(guān)鍵域(REC,RuvC,NUC),引入?yún)f(xié)同優(yōu)化突變:M427F/F487W/D143R/T147R/E151A,獲得了“加強(qiáng)版迷你”CRISPR核酸酶MiniCasUltra,在編輯效率提升的同時(shí)使基因組靶向范圍也得到拓展。
研究團(tuán)隊(duì)改進(jìn)得到的MiniCasUltra具有超小尺寸(529aa),適配單個(gè)AAV遞送系統(tǒng),相比野生型Un1Cas12f1以及當(dāng)前最優(yōu)變體CasMINI V3.1,編輯效率均顯著提高。
利用本研究中開發(fā)的SNV-PAMDA (Single-Nucleotide Variant PAM Determination Assay)方法,實(shí)驗(yàn)測(cè)得適配MiniCasUltra的PAM,突破經(jīng)典5’-TTTR限制,可識(shí)別非經(jīng)典PAM(5’-WBTR),基因組覆蓋率提升5倍,較Un1Cas12f1有顯著提升。
MiniCasUltra同時(shí)具有低脫靶活性,高安全性。研究人員采用多種方式交叉驗(yàn)證工具的脫靶活性和安全性,其中包括借助Cas-OFFinder對(duì)多個(gè)位點(diǎn)的脫靶序列預(yù)測(cè)并經(jīng)深度測(cè)序驗(yàn)證、利用GUIDE-Seq在全基因組層面驗(yàn)證脫靶情況以及利用PEM-Seq測(cè)試全基因組內(nèi)脫靶造成的染色體重排事件。
得益于MiniCasUltra的小體積,可與兩條sgRNA裝載于同一AAV中實(shí)現(xiàn)多基因靶向。通過單個(gè)AAV載體,裝載MiniCasUltra及靶向PTEN(腫瘤抑制基因)與FAH(酪氨酸代謝酶基因)的sgRNA,在小鼠肝臟實(shí)現(xiàn)高效編輯,證實(shí)超緊湊系統(tǒng)在多重基因編輯中的應(yīng)用潛力。
在模擬濕性黃斑變性(nAMD)的人源化VEGFA小鼠脈絡(luò)膜新生血管(CNV)模型中,利用MiniCasUltra獲得的非經(jīng)典PAM識(shí)別能力(5’-TCTG PAM),靶向人源VEGFA(血管內(nèi)皮生長因子A),病理改善包括:熒光素血管造影(FFA)顯示血管滲漏減少;視網(wǎng)膜電圖(ERG)提示光感受器功能恢復(fù);IB4染色證實(shí)CNV病變面積顯著縮小。這項(xiàng)研究首次在nAMD人源化模型中驗(yàn)證了緊湊型CRISPR系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化潛力。
綜上,本研究成功開發(fā)出一個(gè)新的“加強(qiáng)版迷你”基因編輯器MiniCasUltra,融合了“微型化”與“高效能”,保留體積小巧、脫靶風(fēng)險(xiǎn)低的優(yōu)勢(shì)同時(shí),實(shí)現(xiàn)了活性更強(qiáng)、可編輯的基因位點(diǎn)范圍更廣的突破。這一特性使其能在體內(nèi)高效同步編輯多個(gè)基因,并展現(xiàn)出基因編輯治療的潛力。
深圳大學(xué)博士后陳麗和復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院副研究員周旭嬌為該論文的共同第一作者,中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院研究員王宇和復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院教授洪佳旭為共同通訊作者。深圳大學(xué)研究生黃成思,復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院張逸柔、辛昌昌為文章的共同作者,對(duì)研究做出了重要貢獻(xiàn)。本研究還得到了中國科學(xué)院生物物理所研究員王艷麗等在結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析方面的重要幫助。

文章上線截圖

圖1 MiniCasUltra突變位點(diǎn)示意圖與Un1Cas12f1、CasMINI V3.1和SpCas9的基因編輯平行對(duì)比

圖2. MiniCasUltra的PAM特征分析

圖3. MiniCasUltra的基因組靶向特異性

圖4. MiniCasUltra靶向小鼠肝臟的體內(nèi)雙位點(diǎn)編輯

圖5. MiniCasUltra在人源化小鼠濕性黃斑變性模型中靶向視網(wǎng)膜的治療性編輯
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