PNAS | MiniCasUltra:“加強版迷你”基因編輯器
腺相關病毒(AAV)載體因其低免疫原性與組織靶向性,是體內基因治療的標準遞送系統(tǒng)(1)。然而,傳統(tǒng)CRISPR核酸酶(如SpCas9,>1000 aa)的尺寸接近AAV包裝極限(≈4.7 kb),使得AAV載體難以同時容納該核酸酶、sgRNA或更多的調控元件或者效應元件(2,3)。因此尺寸更小的核酸酶是基因編輯領域孜孜不倦追求的重要目標。然而,近年來發(fā)現(xiàn)的緊湊型核酸酶(如Cas12f家族,400-700 aa)雖具尺寸優(yōu)勢(4,5),編輯效率卻顯著低于Cas9/Cas12a,且嚴格的原間隔序列鄰近基序(PAM)要求(如Un1Cas12f1需5-TTTR)大幅限制基因組靶向范圍。
8月5日,中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所王宇團隊聯(lián)合復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院洪佳旭團隊,在國際學術期刊Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS)?發(fā)表了題目為“Engineered Un1Cas12f1 with boosted gene-editing activity and expanded genomic coverage”的研究。本研究通過結構指導的理性設計改造Un1Cas12f1,分析此前發(fā)表的冷凍電鏡結構數(shù)據(jù)(PDB: 7L49)鎖定DNA結合與切割關鍵域(REC,RuvC,NUC),引入?yún)f(xié)同優(yōu)化突變:M427F/F487W/D143R/T147R/E151A,獲得了“加強版迷你”CRISPR核酸酶MiniCasUltra,在編輯效率提升的同時使基因組靶向范圍也得到拓展。
研究團隊改進得到的MiniCasUltra具有超小尺寸(529aa),適配單個AAV遞送系統(tǒng),相比野生型Un1Cas12f1以及當前最優(yōu)變體CasMINI V3.1,編輯效率均顯著提高。
利用本研究中開發(fā)的SNV-PAMDA (Single-Nucleotide Variant PAM Determination Assay)方法,實驗測得適配MiniCasUltra的PAM,突破經(jīng)典5’-TTTR限制,可識別非經(jīng)典PAM(5’-WBTR),基因組覆蓋率提升5倍,較Un1Cas12f1有顯著提升。
MiniCasUltra同時具有低脫靶活性,高安全性。研究人員采用多種方式交叉驗證工具的脫靶活性和安全性,其中包括借助Cas-OFFinder對多個位點的脫靶序列預測并經(jīng)深度測序驗證、利用GUIDE-Seq在全基因組層面驗證脫靶情況以及利用PEM-Seq測試全基因組內脫靶造成的染色體重排事件。
得益于MiniCasUltra的小體積,可與兩條sgRNA裝載于同一AAV中實現(xiàn)多基因靶向。通過單個AAV載體,裝載MiniCasUltra及靶向PTEN(腫瘤抑制基因)與FAH(酪氨酸代謝酶基因)的sgRNA,在小鼠肝臟實現(xiàn)高效編輯,證實超緊湊系統(tǒng)在多重基因編輯中的應用潛力。
在模擬濕性黃斑變性(nAMD)的人源化VEGFA小鼠脈絡膜新生血管(CNV)模型中,利用MiniCasUltra獲得的非經(jīng)典PAM識別能力(5’-TCTG PAM),靶向人源VEGFA(血管內皮生長因子A),病理改善包括:熒光素血管造影(FFA)顯示血管滲漏減少;視網(wǎng)膜電圖(ERG)提示光感受器功能恢復;IB4染色證實CNV病變面積顯著縮小。這項研究首次在nAMD人源化模型中驗證了緊湊型CRISPR系統(tǒng)的轉化潛力。
綜上,本研究成功開發(fā)出一個新的“加強版迷你”基因編輯器MiniCasUltra,融合了“微型化”與“高效能”,保留體積小巧、脫靶風險低的優(yōu)勢同時,實現(xiàn)了活性更強、可編輯的基因位點范圍更廣的突破。這一特性使其能在體內高效同步編輯多個基因,并展現(xiàn)出基因編輯治療的潛力。
深圳大學博士后陳麗和復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院副研究員周旭嬌為該論文的共同第一作者,中國科學院深圳先進技術研究院研究員王宇和復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院教授洪佳旭為共同通訊作者。深圳大學研究生黃成思,復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院張逸柔、辛昌昌為文章的共同作者,對研究做出了重要貢獻。本研究還得到了中國科學院生物物理所研究員王艷麗等在結構生物學分析方面的重要幫助。

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圖1 MiniCasUltra突變位點示意圖與Un1Cas12f1、CasMINI V3.1和SpCas9的基因編輯平行對比

圖2. MiniCasUltra的PAM特征分析

圖3. MiniCasUltra的基因組靶向特異性

圖4. MiniCasUltra靶向小鼠肝臟的體內雙位點編輯

圖5. MiniCasUltra在人源化小鼠濕性黃斑變性模型中靶向視網(wǎng)膜的治療性編輯
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