Cell丨全球最快小鼠全身“高清CT”!單根神經(jīng)纖維清晰可見
中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)、中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院雙聘教授畢國強、劉北明團隊,聯(lián)合合肥綜合性國家科學(xué)中心人工智能研究院在大尺度生物組織三維顯微成像領(lǐng)域取得重大突破。團隊成功開發(fā)出世界最快的小動物全身亞細胞分辨率高清三維成像技術(shù),實現(xiàn)了周圍神經(jīng)系統(tǒng)精細圖譜的高效繪制。相關(guān)成果于7月10日發(fā)表在《細胞》(Cell)上。
周圍神經(jīng)系統(tǒng)作為機體的"物聯(lián)網(wǎng)",承載著大腦與全身器官間的雙向通訊與調(diào)控任務(wù):一方面?zhèn)鬟f運動指令、調(diào)控呼吸心跳等關(guān)鍵功能,另一方面將痛覺、溫度覺等感知信號實時回傳至中樞進行處理,從而協(xié)同各組織器官活動。繪制遍布全身的周圍神經(jīng)系統(tǒng)的精細連接圖譜,是深入理解其復(fù)雜功能機制和相關(guān)疾病機理的關(guān)鍵。
長期以來,科學(xué)家對周圍神經(jīng)系統(tǒng)整體構(gòu)架的認知主要依賴于毫米級分辨率的解剖學(xué)研究。近十年來,三維光學(xué)顯微技術(shù)的進步雖推動了微米級分辨率全腦介觀神經(jīng)圖譜的解析,但對全身周圍神經(jīng)系統(tǒng)的研究仍面臨技術(shù)瓶頸?,F(xiàn)有前沿成像技術(shù)難以同時兼顧高分辨率和高成像速度。即便結(jié)合全身樣品透明化處理,仍難以在小鼠全身尺度以亞細胞分辨率解析周圍神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)雜的長程通路結(jié)構(gòu)。
研究團隊此前開發(fā)了新型同步飛掃技術(shù)(VISoR),該技術(shù)結(jié)合大體積生物樣品厚切片和透明化處理進行三維顯微成像。VISoR兼具高速、高分辨率和可擴展性,可在1.5小時內(nèi)完成小鼠全腦樣品的亞微米分辨率成像(王浩、祝清源等,《國家科學(xué)評論》,2019),并在進一步優(yōu)化后首次實現(xiàn)了獼猴全腦微米分辨率三維成像和單神經(jīng)纖維追蹤(徐放、沈燕、丁露鋒、楊朝宇等,《自然·生物技術(shù)》,2021)。然而,這種先切片后透明化成像的全腦成像策略不適用于小鼠全身樣品。與相對致密、均質(zhì)的大腦不同,小鼠全身組織異質(zhì)性高,包含多樣化的組織類型和不規(guī)則結(jié)構(gòu),在切片過程中極易發(fā)生組織離散和丟失,導(dǎo)致難以完整重構(gòu)。
針對這一技術(shù)難題,團隊提出“樣品原位切片+切面三維成像”的策略,并研發(fā)了整合精密振動切片裝置的blockface-VISoR成像系統(tǒng),以及配套的小鼠全身透明化和水凝膠包埋的樣品制備流程ARCHmap。該技術(shù)流程的核心在于:每次僅對樣品塊表面約600微米深度進行三維成像,然后自動切除已成像的400微米厚度樣品,循環(huán)此過程直至樣品成像完畢。隨后,利用自動化拼接算法對相鄰切片間約200微米的重疊區(qū)域進行三維無縫拼接重構(gòu)。由于每次掃描成像深度僅數(shù)百微米,組織透明化后的光散射效應(yīng)弱,因此能實現(xiàn)高分辨率成像。基于此策略,研究人員建立了優(yōu)化的技術(shù)流程,在40小時內(nèi)完成了成年小鼠全身均一亞細胞分辨率三維成像,獲取單通道約70 TB原始圖像數(shù)據(jù)。目前已累計采集數(shù)十只小鼠數(shù)據(jù),總量超過4 PB。
由于樣品制備方法具備高熒光保存性的優(yōu)勢,ARCHmap-blockface-VISoR技術(shù)兼容神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域常用的轉(zhuǎn)基因和嗜神經(jīng)病毒攜帶的熒光蛋白,以及免疫熒光等標(biāo)記方法。結(jié)合上述標(biāo)記和成像技術(shù),研究人員成功解析了小鼠全身不同類型周圍神經(jīng)的精細結(jié)構(gòu)和單纖維投射路徑,首次揭示了單個脊神經(jīng)元的跨節(jié)段投射特征,闡明了全身交感神經(jīng)的器官特異性伴血管分布模式,并解析了迷走神經(jīng)的整體投射構(gòu)架和單纖維復(fù)雜投射路徑。
研究人員介紹,這項突破性的技術(shù)不僅有助于建立周圍神經(jīng)連接圖譜研究的新范式和解析神經(jīng)調(diào)控結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)性問題,也在發(fā)育生物學(xué)、系統(tǒng)解剖學(xué)和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前景。此外,該技術(shù)仍有改進和優(yōu)化空間,下一步將通過使用雙相機或多相機成像進行多通道圖像同時采集,提高數(shù)據(jù)采集效率,并探索其在更大尺度生物樣品成像領(lǐng)域中的應(yīng)用。
《細胞》期刊審稿人高度評價這項工作,指出“這些分析在群體和單細胞層面均產(chǎn)生了驚人的精細數(shù)據(jù)。尤為重要的是,這項初步探索就揭示了全新的洞見”(These analyses produced strikingly detailed data at both the population and single-cell levels. Importantly, new insights emerged from this initial exploration),并評價:“這是一項有趣的研究,展示精美,其方法學(xué)呈現(xiàn)出巨大的潛力?!保═his is an interesting work, beautifully illustrated, and the methodology shows great potential)。
中國科大特任副研究員時美玉、博士生姚雨辰、王淼和碩士生楊琦為論文共同第一作者。畢國強教授為通訊作者,徐程特任副研究員、劉北明教授和祝清源高級工程師為共同通訊作者。中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)為本項工作的第一完成單位,合肥綜合性國家科學(xué)中心人工智能研究院和中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院分別為第二和第三完成單位。該工作還得到安徽大學(xué)屈磊教授、中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院徐富強研究員、新西蘭奧塔哥大學(xué)張銘教授和Yusuf Ozgur Cakmak教授的協(xié)作支持。此外,該研究獲得國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、科技創(chuàng)新2030—“腦科學(xué)與類腦研究”重大項目、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項、中國科大青年創(chuàng)新基金和安徽省自然科學(xué)基金等項目的資助。

blockface-VISoR成像系統(tǒng)

小鼠全身blockface-VISoR成像流程與周圍神經(jīng)介觀結(jié)構(gòu)解析

研究團隊合影(從左到右:張軻銘、徐程、祝清源、畢國強、劉北明、時美玉、姚雨辰、王淼)
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