Nucleic Acids Research | 科研團(tuán)隊(duì)合作開(kāi)發(fā)非天然核酸(XNA)固相酶促合成平臺(tái)
近日,中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所梅輝副研究員團(tuán)隊(duì)聯(lián)合華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院陳庭堅(jiān)教授團(tuán)隊(duì)在酶促非天然核酸(XNA)的高效合成技術(shù)開(kāi)發(fā)上取得新突破,相關(guān)成果發(fā)表在國(guó)際頂級(jí)期刊Nucleic Acids Research雜志上,題目為“A Solid-Phase Enzymatic Synthesis Platform for the Facile Production of 2'-Fluoroarabinonucleic Acid (FANA) and Chimeric XNA Oligonucleotides Using an Evolved XNA Polymerase”。中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所梅輝副研究員和華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院陳庭堅(jiān)教授為共同通訊作者,華南理工大學(xué)博士生張彬良和副研究員杜宇輝為論文的共同第一作者。
非天然核酸(XNA),如2'-氟代阿拉伯核酸(FANA),憑借其獨(dú)特的穩(wěn)定性與功能性,在生物醫(yī)藥、合成生物學(xué)及納米技術(shù)等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。然而,其廣泛應(yīng)用受限于現(xiàn)有合成方法的瓶頸。傳統(tǒng)的固相化學(xué)合成法存在效率低、成本高、環(huán)境污染大等問(wèn)題。近年來(lái),包括陳庭堅(jiān)教授團(tuán)隊(duì)在內(nèi)的多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)對(duì)不同家族的DNA聚合酶和RNA聚合酶進(jìn)行了分子改造,獲得了能夠識(shí)別并加工多種非天然底物的XNA聚合酶突變株,并基于此開(kāi)發(fā)了一系列非天然寡核苷酸的酶法制備策略。然而,現(xiàn)有的酶法合成技術(shù)則常面臨DNA引物和模板去除困難、產(chǎn)物純度不佳等挑戰(zhàn)。因此,開(kāi)發(fā)高效、綠色的XNA合成技術(shù)是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的難題。
在本工作中,團(tuán)隊(duì)首先系統(tǒng)評(píng)估了四種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化的SF變體(SFM4-3、SFM4-6、SFM4-9和SFM5-7)以DNA為模板合成不同長(zhǎng)度FANA的催化活性。通過(guò)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)和測(cè)序分析,進(jìn)一步表征了活性最優(yōu)突變株SFM5-7合成FANA的催化效率與保真度,證實(shí)其具備卓越的合成性能。上述結(jié)果及團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果表明,SFM5-7能夠高效、高保真地催化包括FANA在內(nèi)的多種XNA的合成?;诖?,課題組創(chuàng)新性地開(kāi)發(fā)了固相酶促XNA寡核苷酸合成(SPEXOS)平臺(tái)。該平臺(tái)的核心思路是結(jié)合核糖核苷酸插入與堿性裂解步驟:首先利用SFM5-7在自合成引發(fā)發(fā)夾DNA模板的3'端精確引入一個(gè)核糖核苷酸;隨后將該模板固定于磁珠上,利用SFM5-7在固相表面高效合成目標(biāo)XNA鏈(如FANA、2'-F-RNA、2'-OMe-RNA等);最后,利用氫氧化鈉特異性裂解核糖核苷酸3'端的磷酸二酯鍵,溫和釋放高純度的XNA產(chǎn)物。值得一提的是,通過(guò)T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)處理去除模板末端的磷酸基團(tuán),可實(shí)現(xiàn)模板的再生與循環(huán)利用(經(jīng)2-4輪循環(huán),產(chǎn)物收率仍可達(dá)初始輪的69-88%),顯著提高了XNA合成的可持續(xù)性和經(jīng)濟(jì)性。
隨后,團(tuán)隊(duì)對(duì)該平臺(tái)的普適性進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。該平臺(tái)不僅成功高效合成了純合的FANA、2'-F-RNA、2'-OMe-RNA,更實(shí)現(xiàn)了2'-F-RNA/2'-OMe-RNA、FANA/DNA、FANA/2'-F-RNA、FANA/2'-F-RNA/2'-OMe-RNA、FANA/DNA/2'-OMe-RNA和FANA/DNA/2'-F-RNA/2'-OMe-RNA等多種復(fù)雜嵌合XNA的可控合成,這些產(chǎn)物大多難以通過(guò)依賴(lài)DNA酶的傳統(tǒng)策略獲得。此外,利用該平臺(tái),團(tuán)隊(duì)還實(shí)現(xiàn)了5'端單標(biāo)記(如EdU或dCAm標(biāo)記)和雙標(biāo)記(EdU和dCAm標(biāo)記)的FANA的高效酶法制備,并在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了FANA的各種5'端功能化,為功能化XNA的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供了新工具。接著,團(tuán)隊(duì)還利用該平臺(tái)成功制備出了具有催化活性的FANA核酶(FANAzyme),充分證實(shí)了該平臺(tái)生產(chǎn)功能性XNA分子的能力。
該研究開(kāi)發(fā)的SPEXOS平臺(tái)為XNA的綠色、高效、可持續(xù)生產(chǎn)及5′末端標(biāo)記和功能化提供了新策略。它有效解決了現(xiàn)有技術(shù)的關(guān)鍵瓶頸,避免了昂貴有毒試劑的使用,無(wú)需復(fù)雜的模板設(shè)計(jì),產(chǎn)物純度高,操作簡(jiǎn)便,且模板可循環(huán)利用。該平臺(tái)能夠靈活合成純合XNA、嵌合XNA及其標(biāo)記產(chǎn)物,為非天然核酸(XNA)在生物醫(yī)藥(如高效制備siXNA和XNA適配體藥物),分子診斷(如開(kāi)發(fā)高穩(wěn)定性XNA探針和生物傳感器),合成生物學(xué)(如開(kāi)發(fā)各類(lèi)XNA功能元件)和生物材料(如高效制備各類(lèi)XNA納米結(jié)構(gòu)器件)等領(lǐng)域的全面應(yīng)用提供了必需的工具和技術(shù)平臺(tái)。
該工作得到了廣東省“珠江人才計(jì)劃”引進(jìn)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)、廣東省“珠江人才計(jì)劃”青年拔尖人才項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目、廣東省合成基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、深圳合成基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院等項(xiàng)目的資助。

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圖1. 基于高效非天然核酸聚合酶的固相酶促XNA寡核苷酸合成(SPEXOS)平臺(tái)
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