Angew | 科研團(tuán)隊(duì)揭示紅藻二萜Peyssonnosol在細(xì)菌中的生物合成
近日,中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院卞光凱課題組和波恩大學(xué)Jeroen S. Dickschat課題組合作,在國際期刊Angewandte Chemie International Edition上發(fā)表了題為“Biosynthesis of the Red Algal Diterpene Peyssonnosol in Bacteria”的最新研究成果。該研究在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了兩種二萜合酶AbPS1和AbPS2,它們分別合成Peyssonnosol和Peyssonnosol B。通過運(yùn)用同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)、DFT計算和定點(diǎn)誘變技術(shù),研究團(tuán)隊(duì)深入解析了它們的酶機(jī)制,得到了與生物合成相關(guān)的關(guān)鍵分子。通過將擴(kuò)展的實(shí)驗(yàn)方法與計算化學(xué)相結(jié)合,并經(jīng)過迭代優(yōu)化,最終建立了一個精細(xì)的機(jī)制模型,為理解萜烯環(huán)化級聯(lián)反應(yīng)提供了重要的見解。
2019年,Kubanek課題組首次從紅藻Peyssonnelia sp.中分離出兩種硫酸化二萜糖苷——peyssonnosides A(1)和B(2)(圖2)。其結(jié)構(gòu)新穎復(fù)雜且具有多樣化生物活性,使得peyssonnosides成為有機(jī)合成化學(xué)家極具挑戰(zhàn)性但前景廣闊的分子靶標(biāo)。在過去的幾年里,已有兩例(-)-peyssonnoside A的全合成報道(JACS.?2021, 143, 14083?14088;JACS. 2022, 144, 19700?19703)。然而,其高成本和低產(chǎn)率凸顯了peyssonnoside A全合成路線的巨大挑戰(zhàn)。迄今為止,peyssonnoside核心二萜骨架的生物合成途徑仍未闡明。
本研究從細(xì)菌Anaerolineae bacterium中挖掘出兩個二萜合酶AbPS1和AbPS2。兩個酶與已知細(xì)菌萜烯合酶的序列相似性僅約15%,表明它們代表了一個新的萜類合酶分支。通過工程酵母異源表達(dá)和體外酶催化進(jìn)行功能表征,鑒定了兩個酶的產(chǎn)物分別為Peyssonnosol(3)和Peyssonnosol B(4),二者僅存在羥基位置差異(圖3)。進(jìn)一步通過X-ray確定3和4的絕對構(gòu)型,對比發(fā)現(xiàn)與紅藻中的天然產(chǎn)物1和2的二萜骨架具有相同的絕對構(gòu)型,這暗示我們需要深入研究海洋生物中天然產(chǎn)物的真正來源,這可能改變我們對海洋天然產(chǎn)物生物合成的理解。
接著,研究者通過綜合實(shí)驗(yàn)方法闡明了Peyssonnosol復(fù)雜的環(huán)化級聯(lián)反應(yīng)機(jī)制。首先,通過不同初始底物的喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn),證明了Peyssonnosol起始于(R)-GLPP;隨后,一系列同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)追蹤了反應(yīng)過程中的原子遷移,驗(yàn)證了反應(yīng)過程中的1,2-氫遷移,1,2-甲基遷移以及去質(zhì)子化-再質(zhì)子化過程?;谶@些實(shí)驗(yàn)結(jié)果,研究團(tuán)隊(duì)提出了涉及復(fù)雜多步轉(zhuǎn)化的機(jī)制模型Scheme?1(圖4)。然而,通過DFT計算,發(fā)現(xiàn)F到G的轉(zhuǎn)化存在較高能壘,且整個機(jī)制的局部極小值和局部極大值之間的最大差值高達(dá)+28.7 kcal/mol。這一顯著的計算結(jié)果促使研究者重新審視并探索其他可能的替代環(huán)化機(jī)理。
為了獲得更多酶的副產(chǎn)物以探究其他可能存在的環(huán)化機(jī)理,研究者對AbPS1口袋附近氨基酸殘基進(jìn)行丙氨酸掃描,并從突變體AbPS1-T182A中分離出兩個副產(chǎn)物peyssonnosene(5)和anaerol(6)。此外,對比AbPS1和AbPS2結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),二者口袋附近僅有3個氨基酸殘基差異,通過互換這三個氨基酸殘基,實(shí)現(xiàn)了AbPS2功能從4到3的轉(zhuǎn)化(圖5)。并且在AbPS2-L56V/F75A中分離出了化合物anaerol?B(7),該化合物具有5-4-6-5的融合骨架,如Scheme 2(圖6)所示,副產(chǎn)物anaerol B(7)的形成涉及不同的GGPP起始構(gòu)象,這一發(fā)現(xiàn)展示了萜烯合酶通過控制底物構(gòu)象來產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣性的能力,為理解天然產(chǎn)物多樣性的產(chǎn)生機(jī)制提供了新視角。
經(jīng)過綜合分析,研究者最終確定第三種機(jī)理為最佳模型。如Scheme 3(圖7)所示,該機(jī)理通過(R)-GLPP中間體進(jìn)行,并通過關(guān)鍵的乙烯基旋轉(zhuǎn)改變其構(gòu)象。隨后,經(jīng)歷兩次1,2-氫遷移和一次1,2-甲基遷移,形成中間體F’’。這一改進(jìn)的機(jī)理模型解決了前兩個假設(shè)中的能量問題,提供了一個熱力學(xué)和動力學(xué)都合理的反應(yīng)路徑。
本研究通過綜合運(yùn)用基因組挖掘、同位素標(biāo)記、DFT計算和定點(diǎn)突變等多種技術(shù)手段,首次從細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)并深入表征了能夠合成紅藻特征性二萜化合物的酶,并在原子水平闡明了極其復(fù)雜的萜烯環(huán)化級聯(lián)反應(yīng)機(jī)制。此外,通過酶工程獲得了產(chǎn)生不同產(chǎn)物的變體,揭示了控制產(chǎn)物特異性的關(guān)鍵殘基。提出并驗(yàn)證三種可能的機(jī)理假設(shè),最終確立了經(jīng)由(R)-GLPP和中間體關(guān)鍵構(gòu)象改變的最優(yōu)反應(yīng)路徑。這提示我們:在目前的情況下,可以制定幾種與同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)相一致的機(jī)制。只有將擴(kuò)展的實(shí)驗(yàn)方法與計算化學(xué)相結(jié)合,才能最終得出一個精細(xì)的機(jī)制模型。
中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院客座博士生胡哲輝和德國波恩大學(xué)博士生Zhiyong Yin為本文的共同第一作者,中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院卞光凱研究員和波恩大學(xué)Jeroen S. Dickschat教授為共同通訊作者。此外,感謝南方醫(yī)科大學(xué)羅奇副教授和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)徐娟教授對該工作給予的大力支持。本研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、深圳市重點(diǎn)項(xiàng)目以及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院等項(xiàng)目的支持。

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圖1:紅藻二萜Peyssonnosol在細(xì)菌中的生物合成

圖2:peyssonnosides A (1) and B (2)的結(jié)構(gòu)及其二萜骨架特點(diǎn)

圖3:AbPS1?& AbPS2的功能表征

圖4:Scheme 1:AbPS1和AbPS2從GGPP到產(chǎn)物3-5的環(huán)化機(jī)制

圖5:AbPS1和AbPS2及其突變體的功能分析。

圖6:Scheme 2. AbPS1-L56V-F75A的環(huán)化機(jī)制

圖7:Scheme 3. AbPS1/AbPS2機(jī)制的改進(jìn)模型
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