Nature Communications | 哺乳動物活細(xì)胞內(nèi)可編程重構(gòu)RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的人工基因線路
單細(xì)胞技術(shù)的飛速發(fā)展和各類細(xì)胞圖譜計劃的進(jìn)行,為解析多重時空維度下的細(xì)胞類型和狀態(tài)提供了豐富的分子標(biāo)簽。RNA作為決定細(xì)胞類型和細(xì)胞狀態(tài)多樣性的核心介質(zhì),其表達(dá)失調(diào)或突變可導(dǎo)致各種病變細(xì)胞狀態(tài)的演化,包括腫瘤的發(fā)生。
然而,目前技術(shù)大都止步于RNA檢測或示蹤,無法直接將RNA變化信號轉(zhuǎn)化為對細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)控信號。最新的RNA傳感器eToehold switch、ADAR switch雖然彌補了RNA濃度感應(yīng)領(lǐng)域的空白,但尚不能靈活地感應(yīng)點突變,并存在可設(shè)計性差、脫靶毒性等問題。
10月10日,中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所婁春波課題組與清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院吳瓊課題組合作,在Nature Communications上發(fā)表動態(tài)感知和激活任意RNA表達(dá)的基因線路的最新研究成果,題為“High-resolution and programmable RNA-IN and RNA-OUT genetic circuit in living mammalian cells”。

文章上線截圖
該工作通過在哺乳動物活細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建具有感應(yīng)及響應(yīng)功能的RNA-IN/RNA-OUT基因線路,實現(xiàn)任意內(nèi)源RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu);且具備活細(xì)胞內(nèi)RNA序列點突變的感知能力,首次將單點突變感知能力由1.5倍提升至94倍;在干細(xì)胞分化狀態(tài)感知、細(xì)胞內(nèi)源性孕激素合成代謝途徑激活和腫瘤細(xì)胞點突變識別和選擇性消殺等多種細(xì)胞治療與基因治療場景中展示出了廣泛的應(yīng)用潛力,為細(xì)胞命運的精準(zhǔn)操控提供了全新的工具箱。
如何在活細(xì)胞中精準(zhǔn)、高效、可編程地感應(yīng)廣譜RNA濃度和序列的動態(tài)變化,并對特定的靶細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控操縱仍是生命科學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。
本研究提出一種新策略,旨在開發(fā)活細(xì)胞內(nèi)高靈敏、可編程、單核苷酸分辨率的RNA感應(yīng)及響應(yīng)基因線路,命名為RNA-IN/RNA-OUT。該線路主要包括三個模塊:上游負(fù)責(zé)內(nèi)源RNA輸入的RNA識別感知模塊(實現(xiàn)RNA-IN)、下游負(fù)責(zé)內(nèi)源RNA表達(dá)輸出的效應(yīng)模塊(實現(xiàn)RNA-OUT),以及負(fù)責(zé)RNA信息呈遞的處理模塊(圖1)。

圖1. RNA-IN/RNA-OUT工作原理示意圖
研究團(tuán)隊首先通過“識別-激活”的策略構(gòu)建了一個可編程的RNA傳感器,命名為CASP傳感器,發(fā)揮RNA動態(tài)信號的感知功能,構(gòu)成RNA-IN模塊。CASP傳感器包含可編程的RNA結(jié)合蛋白(DiCas7-11)和效應(yīng)蛋白(轉(zhuǎn)錄激活因子CI434及激活域VP64)兩個部分。CASP傳感器跟隨crRNA引導(dǎo)激活蛋白酶活性,釋放錨定在細(xì)胞膜的效應(yīng)蛋白,達(dá)到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的目的。在精密設(shè)計的基礎(chǔ)上,為了實現(xiàn)對廣譜RNA的靈敏感應(yīng),研究團(tuán)隊系統(tǒng)地調(diào)試與優(yōu)化了CASP 傳感器中的各個元件,成功檢測到內(nèi)源表達(dá)低至8個轉(zhuǎn)錄本每百萬條轉(zhuǎn)錄本(TPM)(圖2)。

圖2. 可編程CSAP傳感器的設(shè)計與表征(RNA-IN)
除了RNA的表達(dá)異常,基因突變亦是導(dǎo)致癌癥、血管、神經(jīng)性疾病等體細(xì)胞病變的重要原因。但野生型與突變型RNA序列之間往往僅有單個核苷酸突變的微小差異,難檢測也對RNA-IN模塊的感應(yīng)分辨率提出了更具挑戰(zhàn)性的要求。然而,CASP傳感器中,RNA感應(yīng)關(guān)鍵元件“DiCas7-11”對單堿基突變有較高的容忍度,不足以實現(xiàn)單點突變的檢測。
研究團(tuán)隊系統(tǒng)地探索了DiCas7-11對堿基錯配的容忍臨界點,通過引入輔助突變位點的協(xié)同策略,在crRNA與目標(biāo)RNA序列之間形成單堿基錯配差,首次將原本不可檢測的單點突變RNA感應(yīng)由1.5倍提升至94倍。由此,成功實現(xiàn)單堿基突變的檢測,也將RNA表達(dá)量的感應(yīng)擴(kuò)展至序列變化的感應(yīng),極大地豐富了RNA-IN模塊的識別范圍。特別是在腫瘤關(guān)鍵基因KRAS、TP53、BRAF、PIK3CA、EGFR等代表性點突變的檢測中,CASP感應(yīng)器展示出靈敏的識別能力(圖3)。

圖3. 協(xié)同性CASP傳感器對單核苷酸突變的感應(yīng)與響應(yīng)(RNA-IN)
進(jìn)一步地,研究團(tuán)隊將CASP傳感器(RNA-IN)與可編程的dSpCas9-VPR內(nèi)源性激活器(RNA-OUT)連接,以構(gòu)成完整的RNA-IN/RNA-OUT基因線路。利用該基因線路對細(xì)胞內(nèi)不同表達(dá)水平的RNA感應(yīng),及受環(huán)境因素刺激時細(xì)胞內(nèi)部動態(tài)變化RNA的感應(yīng),最終實現(xiàn)了特定基因的轉(zhuǎn)錄激活(圖4)。

圖4. RNA-IN/RNA-OUT基因線路的設(shè)計與優(yōu)化
最后,研究團(tuán)隊在不同的細(xì)胞類型中充分展示了RNA-IN/RNA-OUT基因線路對內(nèi)源性RNA的超敏感知和靈活操縱能力,包括:(1)連接持續(xù)表達(dá)的RNA以激活孕酮的內(nèi)源性生物合成代謝網(wǎng)絡(luò);(2)動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞狀態(tài)變化;(3)識別特征點突變的RNA選擇性殺死胰腺癌和肝癌細(xì)胞(圖5)。

圖5. RNA-IN/RNA-OUT基因線路的應(yīng)用拓展
綜上所述,RNA-IN/RNA-OUT基因線路具有高靈敏、可編程、單堿基分辨率的特點;該線路在活細(xì)胞內(nèi)感應(yīng)RNA動態(tài)變化并直接轉(zhuǎn)換為特定基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控指令,在任意的RNA之間建立強(qiáng)關(guān)聯(lián),有潛力重構(gòu)細(xì)胞內(nèi)部RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),賦予細(xì)胞新的生物學(xué)功能。該線路在細(xì)胞與基因治療、細(xì)胞重編程以及化合物的生物合成等領(lǐng)域擁有廣泛的應(yīng)用前景,為細(xì)胞命運的操縱提供了革新性的技術(shù)支持。
清華大學(xué)張敏博士、張雪博士為共同第一作者,婁春波研究員和吳瓊副教授為文章共同通訊作者,清華大學(xué)博士生許永躍、張博和中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院項延會博士做成了重要貢獻(xiàn)。該研究得到了科學(xué)技術(shù)部、國家自然科學(xué)基金、中國科學(xué)院和清華大學(xué)萬科公共衛(wèi)生與健康學(xué)科發(fā)展專項基金的支持。
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