ACS Sensors | CRISPR/Cas12a介導超靈敏免疫分析用于SARS-CoV-2核衣殼蛋白檢測
5月8日,中國科學院深圳先進技術(shù)研究院合成生物學研究所馬英新課題組和湖北大學馬立新課題組印文博士合作在ACS Sensors上發(fā)表了題為《Ultra-Sensitive Detection of the SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein via a Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/Cas12a-Mediated Immunoassay》的補充封面論文。本研究耦合ELISA、RCA和CRISPR/Cas12a系統(tǒng),開發(fā)了一種超靈敏的SARS-CoV-2核衣殼蛋白檢測方法。其檢出限(LOD)低至1 fg/mL,檢測靈敏度比商用ELISA試劑盒(LOD:5.7 × 104?fg/mL)高4個數(shù)量級。該方法具有高的特異性和靈敏度,能夠準確檢測SARS-CoV-2假病毒和臨床樣本,為蛋白類生物標志物的超靈敏免疫測定提供了一種新策略。
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文章上線截圖
文章鏈接:https://doi.org/10.1021/acssensors.4c00432
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免疫分析是一類常用的生物分析技術(shù),其根據(jù)生物樣本中的抗原-抗體反應(yīng)來檢測和量化靶標分子,并通過與其他物質(zhì)的反應(yīng)轉(zhuǎn)化為輸出信號。在免疫分析方法中,酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)具有通量高、操作簡單等優(yōu)點,因此是多組分分析中最常用的技術(shù)。然而,常規(guī)ELISA存在無法檢測低豐度生物標志物的問題。近年來,成簇規(guī)律間短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)被廣泛應(yīng)用于分子診斷。CRISPR RNA (crRNA)與靶標DNA結(jié)合后,能夠激活Cas12a的順式切割活性,對靶標雙鏈DNA進行特異性切割,并對環(huán)境中游離的單鏈DNA進行非特異性切割,產(chǎn)生熒光信號。研究團隊將高靈敏的CRISPR/Cas12a系統(tǒng)與滾環(huán)擴增(rolling circle amplification,RCA)聯(lián)用,并耦合ELISA,有效解決了ELISA無法檢測低豐度生物標志物的問題。
本研究成功開發(fā)了一種超靈敏的免疫分析法,用于檢測SARS-CoV-2核衣殼(N)蛋白。如圖1所示,SRAS-CoV-2 N蛋白被包被在孔板上的抗體捕獲后,再依次與一抗、二抗、鏈霉親和素、生物素偶聯(lián)引物結(jié)合,形成三明治狀免疫復合物。掛鎖探針被連接酶環(huán)化后,在聚合酶的作用下啟動RCA產(chǎn)生單鏈DNA。CRISPR/Cas12a與單鏈DNA結(jié)合后,能激活其反式切割活性,切割FAM-ssDNA-BHQ1探針,釋放熒光信號,從而實現(xiàn)對SARS-CoV-2 N蛋白的超高靈敏檢測。
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圖1 CRISPR/Cas12a介導的SARS-CoV-2 N蛋白檢測免疫分析示意圖。(a) 捕獲抗體捕獲N蛋白,隨后與第一抗體、生物素化第二抗體、鏈霉親和素結(jié)合,形成免疫復合物;(b) 在phi29 DNA聚合酶的作用下,生物素化引物以連接的環(huán)狀掛鎖為模板,啟動RCA反應(yīng),產(chǎn)生長ssDNA;(c) CRISPR/Cas12a識別長ssDNA鏈,反式切割游離的FAM-ssDNA-BHQ1。
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在該研究中,團隊首先對RCA和CRISPR/Cas12a系統(tǒng)進行可行性評估。實驗結(jié)果表明,CRISPR/Cas12a系統(tǒng)能夠識別RCA產(chǎn)物并產(chǎn)生熒光信號。隨后,團隊開發(fā)了一種結(jié)合ELISA、RCA和CRISPR/Cas12a的免疫分析法。檢測結(jié)果顯示,隨著N蛋白濃度逐漸增加,熒光信號逐漸上升,且濃度的對數(shù)與熒光信號呈良好的線性關(guān)系(圖2A-C),LOD低至1?fg/mL,檢測效果顯著優(yōu)于商用ELISA試劑盒,檢測靈敏度高4-5個數(shù)量級(圖2D)。此外,該方法對SARS-CoV-2 N蛋白展現(xiàn)出良好的檢測特異性(圖3A)。將本研究方法與商品化試劑盒用于SARS-CoV-2假病毒檢測,結(jié)果表明,本方法能夠準確區(qū)分陽性和陰性樣本,而商用試劑盒則無法實現(xiàn)(圖3B-C)。同時,使用本方法對新冠病毒臨床樣本進行分析,結(jié)果表明該方法具有100%的準確性(圖3D)。
綜上所述,團隊成功構(gòu)建了一種耦合ELISA、RCA和CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的超靈敏免疫分析方法,實現(xiàn)了對SARS-CoV-2 N蛋白的超高靈敏檢測。CRISPR/Cas12a介導的免疫分析可顯著提升檢測靈敏度,為傳染性疾病等的超早期精準診斷提供重要的技術(shù)手段,有望解決生物研究和臨床診斷領(lǐng)域在超靈敏檢測方面的關(guān)鍵需求。
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圖2 CRISPR/Cas12a介導的N蛋白檢測免疫分析法。(A)在CRISPR/Cas12a介導的ELISA實驗中,不同濃度N蛋白下報告探針響應(yīng)的熒光光譜;(B)和(C)為N蛋白濃度的對數(shù)與520 nm處熒光強度間的線性關(guān)系,濃度范圍分別為3 fg/mL至1?×?106 fg/mL和1 ×?106 fg/mL至3 ×?107 fg/mL;(D)商用ELISA試劑盒用于N蛋白檢測的線性關(guān)系(1 ×?105 fg/mL至6 ×?106 fg/mL)。
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圖3 選擇性研究與病毒樣本檢測。(A)?SARS-CoV-2 N蛋白的選擇性研究。N蛋白濃度為5 ng/mL,其他蛋白濃度均為50 ng/mL;(B)商用ELISA試劑盒和(C) CRISPR/Cas12a介導的免疫分析法用于檢測SARS-CoV-2假病毒樣本。其中,1至3號樣本為陰性樣本,4至8號樣本為陽性樣本;(D)新冠病毒患者臨床樣本分析。1-8號為陰性樣本,9-26號為陽性樣本。LOD =?blank + 3 × 標準偏差。
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湖北大學印文博士、中國科學院深圳先進技術(shù)研究院與湖北大學聯(lián)合培養(yǎng)碩士研究生李樂遙、深圳市第三人民醫(yī)院楊揚研究員為文章的并列第一作者。中國科學院深圳先進技術(shù)研究院合成生物學研究所的馬英新研究員和毛國斌副研究員為該論文的共同通訊作者。中國科學院深圳先進技術(shù)研究院梁銳晶副研究員、湖北大學馬立新教授與中國農(nóng)業(yè)科學院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所戴俊彪研究員參與了該研究。
該項目得到了國家自然科學基金、科技部、中國科學院、廣東省、深圳市及深圳合成生物學創(chuàng)新研究院等多個項目的支持。
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