Cell reports medicine | 超聲可視化在體調(diào)控腫瘤內(nèi)細(xì)菌基因表達(dá)治療腫瘤
4月18日,中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成所嚴(yán)飛研究員團(tuán)隊與南華大學(xué)附屬長沙中心醫(yī)院陳智毅教授團(tuán)隊合作的最新成果以“Ultrasound-visible engineered bacteria for tumor chemo-immunotherapy”為題在線發(fā)表于Cell子刊Cell reports medicine。在該工作中,研究團(tuán)隊構(gòu)建了一種超聲可視化工程細(xì)菌(Ec@DIG-GVs),內(nèi)部含有聲學(xué)報告基因和溫控基因表達(dá)線路,表面修飾了阿霉素(DOX)化療藥物。這些工程化的腫瘤靶向細(xì)菌可以表達(dá)聲學(xué)報告基因產(chǎn)生氣體囊泡(GVs),為聚焦超聲(hHIFU)提供實時成像引導(dǎo),使超聲焦點(diǎn)能精準(zhǔn)定位于腫瘤內(nèi)的工程化細(xì)菌,誘導(dǎo)細(xì)菌在腫瘤局部表達(dá)和分泌IFN-γ。IFN-γ的產(chǎn)生不僅可以殺死腫瘤細(xì)胞,還可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞從M2表型向M1表型極化,促進(jìn)DC細(xì)胞成熟。此外,工程化細(xì)菌表面的DOX可在腫瘤酸性微環(huán)境中釋放,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡。IFN-γ和DOX的共同作用激活腫瘤特異性T細(xì)胞反應(yīng),產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)大大增強(qiáng)了抗腫瘤的效果。該研究發(fā)展了一種在體可視化調(diào)控腫瘤靶向細(xì)菌基因表達(dá)的新策略,在細(xì)菌、免疫細(xì)胞、干細(xì)胞等活體細(xì)胞在體基因表達(dá)調(diào)控方面具有巨大的潛在應(yīng)用價值。中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成所嚴(yán)飛研究員與南華大學(xué)附屬長沙中心醫(yī)院陳智毅教授為論文的共同通訊作者。中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院前客座學(xué)生楊曜彰為第一作者。

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原文鏈接:https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2024.101512
合成生物學(xué)技術(shù)與腫瘤靶向細(xì)菌的整合極大地提高了細(xì)菌對腫瘤內(nèi)部微環(huán)境或外部物理刺激的響應(yīng)性能,使在體精準(zhǔn)調(diào)控治療基因的表達(dá)成為可能。目前,研究者結(jié)合各種啟動子元件已開發(fā)了多種化學(xué)、物理和生物方法,以實現(xiàn)工程化細(xì)菌在腫瘤部位精準(zhǔn)調(diào)控治療基因的表達(dá)。然而,利用靜脈注射化學(xué)誘導(dǎo)物存在毒副作用且難于靶向聚集腫瘤部位,群體感應(yīng)誘導(dǎo)系統(tǒng)存在基因誘導(dǎo)時間不可控等問題;利用光控或聲控等物理刺激手段具有靶向精準(zhǔn)刺激、時空分辨率高、開啟或關(guān)閉便捷等優(yōu)勢,但光控刺激存在組織穿透性不足,限制了其在深部腫瘤中的應(yīng)用;相比之下,超聲具有高的組織穿透性,優(yōu)良的時空分辨率,不僅可以實時成像,還可以將聲波進(jìn)行聚焦于深部腫瘤部位產(chǎn)生熱效應(yīng)用于基因的表達(dá)調(diào)控。在之前的研究中(Nat Commun. 2022;13:4468),研究團(tuán)隊開發(fā)了一種超聲響應(yīng)性基因線路,將其整合到腫瘤靶向細(xì)菌實現(xiàn)了治療基因在腫瘤部位的時空可控表達(dá),提高了細(xì)菌基因治療腫瘤的有效性和安全性。然而,由于細(xì)菌在腫瘤內(nèi)部分布不均以及超聲焦點(diǎn)難于監(jiān)測,目前仍然無法可視化這些腫瘤內(nèi)部的工程化細(xì)菌,并實現(xiàn)影像引導(dǎo)超聲精準(zhǔn)定位腫瘤內(nèi)細(xì)菌調(diào)控治療基因的表達(dá)。為此,嚴(yán)飛研究員團(tuán)隊和陳智毅教授團(tuán)隊研發(fā)了一種超聲可視化工程細(xì)菌(Ec@DIG-GVs),可在超聲成像引導(dǎo)下精準(zhǔn)調(diào)控腫瘤內(nèi)工程化細(xì)菌的基因表達(dá),為腫瘤治療提供了一種新的策略。
研究團(tuán)隊首先將聲學(xué)報告基因(ARG1)質(zhì)粒和溫控基因線路(IFN-γ)質(zhì)粒依次導(dǎo)入至大腸桿菌MG1655中,獲得了Ec@IG,接著在體外誘導(dǎo)Ec@IG內(nèi)的聲學(xué)報告基因表達(dá)GVs獲得含生物納泡細(xì)菌Ec@IG-GVs。最后,利用化學(xué)修飾策略將阿霉素連接至Ec@IG-GVs表面制備獲得了超聲可視化的工程化細(xì)菌Ec@DIG-GVs。透射電鏡及相差顯微鏡結(jié)果證實Ec@DIG-GVs細(xì)菌內(nèi)部表達(dá)了大量的生物納泡(GVs),免疫熒光標(biāo)記和吸收光值測定表明阿霉素成功偶聯(lián)至細(xì)菌表面(圖1)。

圖1. 超聲可視化細(xì)菌的制備
研究團(tuán)隊進(jìn)一步對Ec@DIG-GVs的各項功能進(jìn)行了驗證。首先確認(rèn)了含GVs的Ec@DIG-GVs具有超聲造影成像信號且具有濃度依賴性增強(qiáng)。同時,為了驗證超聲成像引導(dǎo)hHIFU刺激工程化細(xì)菌內(nèi)溫控基因線路表達(dá)外源基因的可行性,研究團(tuán)隊將Ec@IG-GVs中的IFN-γ基因替換為mCherry報告基因(Ec@MG-GVs),并將該細(xì)菌包埋至瓊脂凝膠內(nèi)(上層為含泡細(xì)菌,下層為不含泡細(xì)菌),在超聲成像引導(dǎo)下將hHIFU焦點(diǎn)定位至Ec@MG-GVs處輻照25分鐘,結(jié)果顯示hHIFU輻照的區(qū)域由于GVs的爆破出現(xiàn)了超聲信號的消失,37°C放置6小時后發(fā)現(xiàn)僅僅接收hHIFU的區(qū)域出現(xiàn)了明顯的紅色熒光,表明工程化細(xì)菌可以實現(xiàn)超聲造影引導(dǎo)hHIFU定點(diǎn)誘導(dǎo)mCherry蛋白的表達(dá)。此外,通過將Ec@DIG-GVs置于不同pH值條件下,證實了DOX能夠?qū)崿F(xiàn)酸響應(yīng)性釋放并有效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞(圖2)。

圖2. 超聲可視化細(xì)菌的功能表征
隨后,研究團(tuán)隊測試了Ec@DIG-GVs的腫瘤細(xì)胞殺傷活性和免疫激活的情況,將Ec@DIG-GVs進(jìn)行酸性處理并給予hHIFU輻照誘導(dǎo)IFN-γ的表達(dá),離心去除細(xì)菌后獲得了含有DOX和IFN-γ的上清液。將該上清液與腫瘤細(xì)胞孵育后,可見腫瘤細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡和免疫原性死亡(CRT、HMGB1蛋白標(biāo)志物的檢測)。將該上清液與巨噬細(xì)胞共孵育后發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞占比明顯增加,說明Ec@DIG-GVs所釋放的IFN-γ和DOX具有殺傷腫瘤并能誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞極化(圖3)。

圖3. 超聲可視化細(xì)菌表達(dá)IFN-γ并釋放DOX殺傷腫瘤細(xì)胞并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化
接著研究團(tuán)隊將該工程化細(xì)菌應(yīng)用到荷瘤小鼠中,通過瘤內(nèi)注射Ec@MG或Ec@MG-GVs,發(fā)現(xiàn)Ec@MG-GVs展現(xiàn)出良好的腫瘤內(nèi)超聲成像能力,通過超聲成像定位腫瘤內(nèi)細(xì)菌位置并引導(dǎo)hHIFU進(jìn)行輻照。結(jié)果顯示在同一個腫瘤內(nèi)僅僅經(jīng)過hHIFU輻照的區(qū)域超聲信號消失,4小時后輻照區(qū)有紅色熒光產(chǎn)生(mCherry蛋白表達(dá)),而未輻照區(qū)域無紅色熒光。切片結(jié)果顯示輻照區(qū)域所產(chǎn)生的紅色熒光呈近似圓形,能與hHIFU輻照焦點(diǎn)相對應(yīng)。利用該方法進(jìn)行超聲成像引導(dǎo)hHIFU輻照Ec@DIG-GVs進(jìn)行腫瘤治療,腫瘤生長可以得到明顯的抑制,并延長荷瘤小鼠的生存期(圖4)。

圖4. 瘤內(nèi)注射超聲可視化細(xì)菌的抗腫瘤效果驗證
在確認(rèn)瘤內(nèi)注射工程化細(xì)菌聯(lián)合超聲輻照能取得較好的治療效果后,研究團(tuán)隊進(jìn)一步測試了該工程化細(xì)菌靜脈注射后的腫瘤靶向能力,為便于觀察,將ICG替換DOX修飾至Ec@IG-GVs表面獲得Ec@IIG-GVs,靜脈注射Ec@IIG-GVs后,腫瘤及各主要器官熒光成像結(jié)果表明Ec@IIG-GVs具有較好的腫瘤靶向聚集能力。重要的是,研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)靜脈注射Ec@IIG-GVs后,腫瘤內(nèi)超聲成像信號隨時間逐漸增加,與熒光成像靶向驗證結(jié)果相一致(圖5),表明工程化細(xì)菌還可實現(xiàn)在腫瘤內(nèi)的超聲成像示蹤。

圖5 超聲可視化細(xì)菌的腫瘤靶向驗證
基于該工程細(xì)菌良好的腫瘤靶向性,研究團(tuán)隊進(jìn)一步檢測了靜脈注射Ec@DIG-GVs聯(lián)合超聲誘導(dǎo)IFN-γ基因表達(dá)治療腫瘤的效果,在靜脈注射Ec@DIG-GVs后,通過超聲成像確定工程化細(xì)菌到達(dá)腫瘤的時間和位置,引導(dǎo)hHIFU輻照誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)細(xì)菌IFN-γ的表達(dá)。結(jié)果表明,在IFN-γ和DOX的共同作用下,Ec@DIG-GVs+hHIFU處理組顯著抑制了腫瘤生長,延長了荷瘤小鼠生存時間,進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)超聲成像引導(dǎo)hHIFU輻照Ec@DIG-GVs(Ec@DIG-GVs+hHIFU組)顯著不僅促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡,還促進(jìn)了腫瘤內(nèi)DC細(xì)胞成熟,M2型巨噬細(xì)胞向M1型極化,有效激活了機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)(圖6)。

圖6. 靜脈注射超聲可視化細(xì)菌的抗腫瘤與免疫激活效應(yīng)
該工作獲得了國家科技部重點(diǎn)研發(fā)計劃項目、國家自然科學(xué)基金面上項目及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院等項目的支持。
參考文獻(xiàn):
Yaozhang Yang;Yuanyuan Wang;Fengyi Zeng;Yuhao Chen;Zhiyi Chen;Fei Yan. Ultrasound-visible engineered bacteria for tumor chemo-immunotherapy. Cell reports medicine, 2024.
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