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　　北京時(shí)間2月6日，中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成所羅小舟團(tuán)隊(duì)與Jay D. Keasling團(tuán)隊(duì)合作在Advanced Science發(fā)表題為Pathway evolution through a bottlenecking-debottlenecking strategy and machine learning-aided flux balancing的文章。 

　　這項(xiàng)研究旨在解決代謝途徑工程中的一個(gè)關(guān)鍵性問(wèn)題：基因上位效應(yīng)限制了其進(jìn)化潛力和適應(yīng)性，導(dǎo)致進(jìn)化過(guò)程的不確定性。例如，一個(gè)酶的微小改造可能會(huì)使另一個(gè)酶成為途徑的瓶頸，這可能需要數(shù)千年才能增強(qiáng)或開(kāi)發(fā)新功能。因此，如何以更少的進(jìn)化時(shí)間和迭代次數(shù)達(dá)到數(shù)千年自然進(jìn)化過(guò)程所需的效果，一直是該領(lǐng)域研究的難點(diǎn)。針對(duì)上述問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)利用自動(dòng)化大設(shè)施平臺(tái)技術(shù)，確定可控的進(jìn)化軌跡，實(shí)現(xiàn)了代謝通路多個(gè)關(guān)鍵性基因的自動(dòng)化同步進(jìn)化。該研究還搭載了ProEnsemble機(jī)器學(xué)習(xí)框架，進(jìn)一步緩解了進(jìn)化途徑各基因間的上位效應(yīng)影響，進(jìn)而創(chuàng)造了一個(gè)高效的通用型底盤(pán)來(lái)合成黃酮化合物。這項(xiàng)工作（DOI: 10.1002/advs.202306935）可以有效克服代謝途徑進(jìn)化不確定性的技術(shù)難題。這是羅小舟團(tuán)隊(duì)在2023年開(kāi)發(fā)酶挖掘與進(jìn)化的UniKP大語(yǔ)言模型框架后（Nat. Commun. 2023），在IT和BT交叉領(lǐng)域的又一重要進(jìn)展。這項(xiàng)研究還融合了自動(dòng)化技術(shù)和機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，可以顯著提高底盤(pán)開(kāi)發(fā)的速度和效率，減少研發(fā)時(shí)間，降低經(jīng)濟(jì)成本。這也為推進(jìn)生物智能制造領(lǐng)域的發(fā)展，提供了前沿的技術(shù)路線和全新的解決方案。 

　　探秘代謝途徑進(jìn)化“速度之謎”：基因上位效應(yīng)是否存在？ 

　　在本項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)試圖解決一個(gè)合成生物學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)問(wèn)題：如何在特定的進(jìn)化軌跡中獲得最優(yōu)的突變組合。但是，不同突變組合在不同的背景下會(huì)呈現(xiàn)出不同的表現(xiàn)，該種現(xiàn)象稱為基因上位效應(yīng)。這種效應(yīng)將導(dǎo)致途徑進(jìn)化的不確定性，限制進(jìn)化潛力和適應(yīng)性。為了驗(yàn)證這個(gè)現(xiàn)象，研究團(tuán)隊(duì)以柚皮素代謝途徑為例，首先確定了TAL有義突變體，然后在不同的基因組合背景下評(píng)估了其適應(yīng)性，最終證實(shí)了基因上位效應(yīng)在代謝途徑進(jìn)化過(guò)程中的普遍存在。 

　　首先，將TAL基因放置于不同拷貝數(shù)、弱啟動(dòng)子質(zhì)粒，其余關(guān)鍵性代謝基因維持原質(zhì)粒（圖1），發(fā)現(xiàn)當(dāng)TAL基因被放置在中高拷貝數(shù)質(zhì)粒ColE1時(shí)能獲得最高柚皮素產(chǎn)量。然而，在該背景質(zhì)粒下，直接篩選TAL的隨機(jī)突變庫(kù)時(shí)，未能獲得產(chǎn)量更高的有義突變體，揭示了復(fù)雜的基因上位效應(yīng)可能誘發(fā)途徑進(jìn)化陷入局部最優(yōu)解。為解決該問(wèn)題，該團(tuán)隊(duì)將TAL隨機(jī)突變庫(kù)置于低拷貝數(shù)質(zhì)粒，以創(chuàng)造一個(gè)人工代謝瓶頸，確保TAL的表達(dá)和活性是限制柚皮素產(chǎn)量的唯一因素。在這種情況下，突變體的進(jìn)化軌跡更為清晰，在產(chǎn)量達(dá)到其本身在中高拷貝數(shù)質(zhì)粒上所能達(dá)到的最高產(chǎn)量之前，理論上不會(huì)遇到中間體毒性或復(fù)雜調(diào)控等問(wèn)題而導(dǎo)致進(jìn)化的不確定性問(wèn)題。基于此，研究團(tuán)隊(duì)獲得了7株在該背景下能顯著提升柚皮素產(chǎn)量的TAL突變體，并確認(rèn)了其突變位點(diǎn)。隨后，將野生型TAL及7種變體放置于中高質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)所有TAL變體的柚皮素產(chǎn)量均低于其野生型的最高產(chǎn)量（357.66 mg/L）。上述結(jié)果證實(shí)了TAL基因置于中高拷貝數(shù)質(zhì)粒（如ColE1 origin）時(shí)，基因上位效應(yīng)可能會(huì)掩蓋柚皮素的有義突變體，導(dǎo)致代謝途徑在直接進(jìn)化中往往只能達(dá)到次優(yōu)水平；這也解釋了途徑進(jìn)化常出現(xiàn)微小或無(wú)明顯效果的原因。 

　　自動(dòng)化平臺(tái)加速代謝途徑同步進(jìn)化：開(kāi)辟酶活性與適應(yīng)性新視野 

　　改變外部環(huán)境可重塑途徑進(jìn)化適應(yīng)度特性，解決代謝途徑進(jìn)化陷入局部最優(yōu)解的困局。因此，研究團(tuán)隊(duì)逐個(gè)降低各關(guān)鍵基因表達(dá)水平，進(jìn)而改變代謝途徑關(guān)鍵性基因進(jìn)化的適應(yīng)性。為了達(dá)成同步自動(dòng)化輔助酶進(jìn)化，研究團(tuán)隊(duì)還進(jìn)行了如下設(shè)計(jì)：1）僅用終產(chǎn)物柚皮素響應(yīng)的分子探針系統(tǒng)作為評(píng)估途徑代謝能力的標(biāo)準(zhǔn)，以實(shí)現(xiàn)統(tǒng)一的篩選方法；2）搭載自動(dòng)化大設(shè)施平臺(tái)技術(shù)，在清晰進(jìn)化軌跡內(nèi)實(shí)現(xiàn)各基因同步、迭代進(jìn)化。 

　　該自動(dòng)化大設(shè)施平臺(tái)2周內(nèi)可實(shí)現(xiàn)挑菌、培養(yǎng)、突變庫(kù)篩選、備選突變體產(chǎn)物提取等常規(guī)流程，整個(gè)操作與手工操作并無(wú)差異，證實(shí)了自動(dòng)化大設(shè)施平臺(tái)在代謝途徑進(jìn)化過(guò)程中的可靠性和準(zhǔn)確性。此外，該平臺(tái)通量可達(dá)到1.1萬(wàn)克隆子分選/次，即單次流程可同步進(jìn)化2個(gè)基因（5000克隆子/每個(gè)基因/單次）或進(jìn)化1個(gè)基因（10000克隆子/每個(gè)基因/單次）。 

　　揭秘基因上位效應(yīng)：重塑代謝途徑的進(jìn)化與適應(yīng)性 

　　為進(jìn)一步解密基因上位效應(yīng)是否普遍存在、且是否會(huì)造成代謝途徑進(jìn)化不確定性等問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)各基因的野生型和有益突變體進(jìn)行了交叉配對(duì)并評(píng)估了各工程菌柚皮素合成能力（圖3與4）。結(jié)果顯示，在4CL和CHS野生型基因組合背景下，所有TAL突變體柚皮素產(chǎn)量顯著降低；而在4CL和CHS突變體組合背景下，野生型TAL柚皮素產(chǎn)量略微增強(qiáng)（圖4）。此外，還發(fā)現(xiàn)了不同基因上位效應(yīng)現(xiàn)象：如TAL-26E7和TAL-28D11 與4CL-11C1和CHS-9H9突變體展現(xiàn)出較強(qiáng)的符合上位效應(yīng)（sign epistasis）；其余TAL突變體呈現(xiàn)出正上位效應(yīng)（positive epistasis）；4CL-11C1與TAL-26E7和CHS-9H9突變體呈現(xiàn)出負(fù)上位效應(yīng)（negative epistasis）；CHS-9H9與TAL-26E7和4CL-11C1突變體展現(xiàn)出雙向符號(hào)上位效應(yīng)（reciprocal sign epistasis）（圖3與4）。這些普遍存在的基因上位效應(yīng)無(wú)疑阻礙了途徑進(jìn)化進(jìn)程，致使途徑進(jìn)化陷入局部最優(yōu)解的困境。此外，高精度預(yù)測(cè)酶突變體的任務(wù)極具挑戰(zhàn)，隨機(jī)突變庫(kù)介導(dǎo)的定向進(jìn)化過(guò)程常為“運(yùn)氣”或“偶然”事件。因此，在清晰軌跡的可控范圍內(nèi)同步進(jìn)化各限速酶，可提高代謝改造過(guò)程的可預(yù)測(cè)性，有效解決代謝進(jìn)化不確定性的問(wèn)題。 

　　優(yōu)化啟動(dòng)子組合數(shù)據(jù)，IT技術(shù)助力進(jìn)一步緩解進(jìn)化通路基因上位效應(yīng) 

　　鑒于基因上位效應(yīng)影響，進(jìn)一步迭代進(jìn)化上述3個(gè)關(guān)鍵性基因可能會(huì)誘發(fā)代謝通路失衡，導(dǎo)致進(jìn)化不確定性。為此，本團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了ProEnsemble機(jī)器學(xué)習(xí)框架（圖5），優(yōu)化進(jìn)化通路啟動(dòng)子組合，緩解進(jìn)化途徑的基因上位效應(yīng)影響。本研究盡可能選取不同分布的數(shù)據(jù)，避免訓(xùn)練進(jìn)入局部最優(yōu)解，根據(jù)Al³⁺信號(hào)，從約1000個(gè)克隆子中收集到相對(duì)平衡的數(shù)據(jù)集，柚皮素產(chǎn)量范圍在50.8至1044 mg/L之間。Top1的NAR1.0菌株柚皮素產(chǎn)量比對(duì)照組高出4.44倍。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行十折交叉驗(yàn)證，評(píng)估13種常規(guī)預(yù)測(cè)器的均方根誤差（Root Mean Square Error, RMSE），隨后通過(guò)前向模型選擇，將誤差最小的預(yù)測(cè)器依次進(jìn)行集成，選擇RMSE最小的集成模型作為最終的預(yù)測(cè)模型。皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Pearson Coefficient Correlation, PCC）也達(dá)到了0.74，顯示出該模型在真實(shí)值和預(yù)測(cè)值之間有更好的相關(guān)性。 

　　該ProEnsemble模型預(yù)測(cè)的Top5菌株柚皮素產(chǎn)量均高于700 mg/L，比隨機(jī)采樣（960樣本有5個(gè)高產(chǎn)菌株）更具高效性和準(zhǔn)確性。然而，該數(shù)據(jù)集仍存在不平衡分布問(wèn)題，可能限制了模型的預(yù)測(cè)能力，導(dǎo)致Top5菌株產(chǎn)量均未超過(guò)NAR1.0菌株。為此，重新從1500個(gè)克隆子中進(jìn)一步擴(kuò)大訓(xùn)練集，分別用高于400、500、600、700和800 mg/L數(shù)據(jù)集優(yōu)化模型。最終，在初始數(shù)據(jù)集中增加27個(gè)高于600 mg/L的數(shù)據(jù)集后，模型表現(xiàn)最佳，PCC從0.74提高到0.82，上述結(jié)果揭示了數(shù)據(jù)集平衡分布對(duì)增強(qiáng)模型性能的重要性。結(jié)果顯示，第二輪預(yù)測(cè)的Top5菌株均能高效合成柚皮素。NAR2.0產(chǎn)量最高，為1.21 g/L，比NAR1.0高出16%，比未經(jīng)啟動(dòng)子優(yōu)化的初始構(gòu)建體高出5.16倍。值得注意的是，隨機(jī)啟動(dòng)子庫(kù)中超過(guò)99.11%的菌株產(chǎn)量低于1g/L，揭示了ProEnsemble集成模型可顯著提升挖掘高產(chǎn)菌株的可能性。 

　　此外，我們用NAR2.0在1L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，12h柚皮素產(chǎn)量為660 mg/L，48h時(shí)達(dá)到3.65 g/L，這是文獻(xiàn)中報(bào)道的直接從酪氨酸生產(chǎn)柚皮素的最高產(chǎn)量，為文獻(xiàn)報(bào)道以酪氨酸為底物對(duì)應(yīng)產(chǎn)量的3.41倍，為香豆酸中間體投喂發(fā)酵產(chǎn)量的3.02倍（圖5）。鑒于本研究?jī)H改造了途徑酶和啟動(dòng)子，未來(lái)的代謝工程策略可進(jìn)一步提高柚皮素產(chǎn)量。 

　　生物智能制造突破：通用型底盤(pán)高效合成黃酮類(lèi)化合物 

　　最后，研究團(tuán)隊(duì)僅通過(guò)過(guò)表達(dá)關(guān)鍵性合成基因，實(shí)現(xiàn)了染料木素、櫻花素和橙皮素等黃酮類(lèi)化合物的高效合成，其中染料木素達(dá)到72.32 mg/L，櫻花素為223.39 mg/L，橙皮素為82.50 mg/L，各黃酮產(chǎn)量均高于文獻(xiàn)報(bào)告水平（借助了一系列代謝工程改造）（圖6）。上述結(jié)果可重塑植物黃酮合成潛能的理解，為高附加值化合物的生產(chǎn)提供了新的思路和策略，展現(xiàn)了生物智能制造在現(xiàn)代工業(yè)中的巨大潛力和應(yīng)用前景。 

　　總結(jié)與展望 

　　針對(duì)基因上位效應(yīng)在途徑進(jìn)化中的普遍性及其帶來(lái)的局部最優(yōu)解困境，本研究團(tuán)隊(duì)以柚皮素代謝途徑為范例，基于自動(dòng)化大設(shè)施平臺(tái)技術(shù)，在清晰進(jìn)化軌跡的可控范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了代謝通路多個(gè)關(guān)鍵性基因的同步進(jìn)化，并借助ProEnsemble機(jī)器學(xué)習(xí)框架，進(jìn)一步緩解了進(jìn)化途徑的基因上位效應(yīng)影響，顯著提升了底盤(pán)開(kāi)發(fā)速度和效率，實(shí)現(xiàn)了柚皮素產(chǎn)量從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的跨越。該項(xiàng)工作不僅攻克了代謝途徑進(jìn)化不確定性的技術(shù)壁壘，減少了研發(fā)時(shí)間并降低了經(jīng)濟(jì)成本，在代謝工程、酶工程等領(lǐng)域及其工業(yè)應(yīng)用中也極具意義：為生物智能制造提供了前沿的技術(shù)路線和全新的解決方案；為合成生物學(xué)在現(xiàn)代工業(yè)中的應(yīng)用開(kāi)辟了新的可能性。 　  

　　中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)院合成生物學(xué)研究所羅小舟研究員與Jay D. Keasling教授為本文的通訊作者，團(tuán)隊(duì)成員助理研究員鄧華祥與碩士研究生余函為文章共同第一作者，研究助理何佳慧、梁維悅、鄧艷午等在生物實(shí)驗(yàn)等方面做出了重要貢獻(xiàn)。該研究獲得國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金委、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金委、深圳市科技計(jì)劃等多個(gè)項(xiàng)目的支持，以及深圳市微生物藥物智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院和定量合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等平臺(tái)的支持。同時(shí)，感謝科研助理魏珍琴在項(xiàng)目實(shí)施過(guò)程中協(xié)助組織會(huì)議討論等支撐工作。

　　圖1 探究柚皮素代謝通路基因上位效應(yīng)（以TAL基因?yàn)槔?/span> 

　　圖2 確認(rèn)柚皮素關(guān)鍵性基因可控范圍內(nèi)的進(jìn)化軌跡 　

　　圖3在清晰進(jìn)化軌跡范圍內(nèi)平行進(jìn)化柚皮素關(guān)鍵性基因（自動(dòng)化大設(shè)施平臺(tái)）與探究基因間上位效應(yīng) 　

　　圖4 探究基因間上位效應(yīng) 

　　表1 柚皮素關(guān)鍵性基因及突變體酶動(dòng)力學(xué)信息匯總 　

　　圖5 機(jī)器學(xué)習(xí)框架ProEnsemble進(jìn)一步緩解進(jìn)化通路各基因間的上位效應(yīng)（機(jī)器學(xué)習(xí)模塊） 

　　圖6 柚皮素底盤(pán)高效合成下游黃酮類(lèi)化合物　　  

　　原文鏈接 

　　課題組招聘 

　　羅小舟，深圳先進(jìn)院合成生物學(xué)研究所研究員，博士生導(dǎo)師，合成生物化學(xué)研究中心執(zhí)行主任、PI，深圳市合成生物研究重大科技基礎(chǔ)設(shè)施副總工藝師，森瑞斯生物科技（深圳）有限公司創(chuàng)始人。2010年于新加坡南洋理工大學(xué)獲得學(xué)士學(xué)位，2016年于美國(guó)圣地亞哥斯克里普斯研究所獲得化學(xué)專業(yè)博士學(xué)位（導(dǎo)師Peter G. Schultz院士），2016-2019于加州大學(xué)伯克利分校進(jìn)行博士后研究（合作導(dǎo)師Jay D. Keasling院士）。2019年加入中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院。先后入選國(guó)家重大人才工程（青年）專家、廣東省杰青、深圳市優(yōu)青、深圳市國(guó)家級(jí)高層次人才、2023南山十大杰出青年等。在Nature, Nature Chemical Biology, Cell Chemical Biology, Nature Synthesis, Nature Communications, PNAS, Angewandte Chemie，Advanced Science，Metabolic Engineering等知名學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表論文40余篇。課題組聚焦于合成生物學(xué)領(lǐng)域中生命體內(nèi)生物化學(xué)過(guò)程相關(guān)研究，主要結(jié)合遺傳密碼擴(kuò)充技術(shù)，酶的定向進(jìn)化，基因挖掘和代謝工程等多種化學(xué)生物學(xué)方法，基于大數(shù)據(jù)機(jī)器學(xué)習(xí)及高通量自動(dòng)化，深入研究多種不同類(lèi)別的天然產(chǎn)物及其衍生物的生物全合成的方法，并利用合成生物學(xué)方法，將研究成果轉(zhuǎn)化至制藥、個(gè)性化治療、新材料等領(lǐng)域。 

　　課題組現(xiàn)長(zhǎng)期誠(chéng)聘生物、化學(xué)、生物信息學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程等交叉學(xué)科背景，或有酶定向進(jìn)化、機(jī)器學(xué)習(xí)、高通量篩選、天然及非天然化合物的生物全合成等研究背景的博士后，歡迎感興趣的同志投遞簡(jiǎn)歷至郵箱xz.luo@siat.ac.cn。