JACS|深圳先進(jìn)院周佳海/浙大杜藝嶺組合作揭示微生物氧化偶氮類天然產(chǎn)物生物合成的酶學(xué)基礎(chǔ)
近日,中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院周佳海課題組和浙江大學(xué)杜藝嶺課題組和合作在JACS上發(fā)表了題為Conserved Enzymatic Cascade for Bacterial Azoxy Biosynthesis的研究論文。該研究揭示了微生物中氧化偶氮類天然產(chǎn)物關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基團(tuán)生物合成的酶學(xué)基礎(chǔ),發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新穎的鐵離子依賴型膜結(jié)合氮-氮鍵合酶和一個(gè)雙鐵家族的氧化偶氮合酶。研究結(jié)果顯示由這兩個(gè)新家族金屬酶共同催化的酶促反應(yīng)序列可能是細(xì)菌中不對(duì)稱氧化偶氮類天然產(chǎn)物生成的保守策略(圖1)。
氮-氮(N-N)鍵結(jié)構(gòu)基團(tuán)是眾多化學(xué)合成類藥物和活性天然產(chǎn)物的重要藥效團(tuán),其生物合成的酶促機(jī)理近年來(lái)獲得了極大關(guān)注(圖2a)。挖掘和研究含氮氮鍵天然產(chǎn)物生物合成途徑中負(fù)責(zé)氮-氮鍵合成的酶家族,可以為通過(guò)合成生物學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)眾多藥物的綠色制造提供理論指導(dǎo)和生物催化元件。氧化偶氮類(Azoxy)天然產(chǎn)物含有共同的官能團(tuán)(RN = N+(O-)R),該家族化合物具有多樣化的結(jié)構(gòu)和生活學(xué)活性,其中包括蘇鐵毒素cycasin、真菌抗生素calvatic acid、抗腫瘤和抗菌分子valanimycin、抗結(jié)核分子elaiomycin和殺線蟲(chóng)分子jietacin等等(圖2b)。同時(shí),氧化偶氮分子也已被鑒定為外源的肼或偶氮類異生物(如許多臨床藥物、食品或染料)在人體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中產(chǎn)生的重要代謝中間產(chǎn)物,其在某些條件下可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為具有致癌作用的重氮離子。盡管對(duì)于不對(duì)稱氧化偶氮類天然產(chǎn)物生物合成機(jī)理的研究已經(jīng)經(jīng)歷了數(shù)十年,但其關(guān)鍵氧化偶氮鍵基團(tuán)形成的酶學(xué)基礎(chǔ)仍然是一個(gè)謎。
研究首先通過(guò)在大腸桿菌體系中部分重構(gòu)valanimycin的生物合成途徑,揭示了膜蛋白VlmO能夠?qū)⒁粋€(gè)不穩(wěn)定的酯中間體2轉(zhuǎn)化為含氮氮鍵的肼基產(chǎn)物4(圖3)。隨后,研究人員通過(guò)將化學(xué)合成的valanimycin生物合成基因簇導(dǎo)入底盤(pán)宿主Streptomyces albus J1074中,成功獲得了valanimycin的生產(chǎn)菌株。進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)基因敲除實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了vlmO基因?qū)τ趘alanimycin的生成是必不可少的?;谀そM分進(jìn)行的體外生化實(shí)驗(yàn)顯示VlmO催化氮氮鍵合成的反應(yīng)活性依賴于金屬鐵離子,因此VlmO是一個(gè)新穎的鐵離子依賴型膜結(jié)合氮-氮鍵合酶。
接下來(lái),研究人員進(jìn)一步探索了valanimycin生物合成途徑中氮氮鍵形成之后的反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)基因簇上編碼的雙鐵金屬蛋白VlmB可以將肼基中間體4轉(zhuǎn)化為含氧化偶氮基的產(chǎn)物3(圖3)。厭氧條件下的反應(yīng)和18O標(biāo)記實(shí)驗(yàn)揭示了氧化偶氮的氧原子來(lái)源于分子氧。有意思的是,VlmO催化的四電子氧化反應(yīng)不需要提供外源的還原劑。UV-vis光譜學(xué)研究和厭氧條件下的中間體鑒定實(shí)驗(yàn)顯示了肼基底物4可以提供電子還原VlmB的雙鐵中心來(lái)激活氧氣分子,肼基底物4自身則被氧化成偶氮中間體12,后者再經(jīng)歷N-氧化反應(yīng)生成valanimycin特征性的氧化偶氮基團(tuán)。VlmB與底物的共晶結(jié)構(gòu)顯示雙鐵中心由四個(gè)谷氨酸殘基 (Glu84, Glu114, Glu180, and Glu212)和兩個(gè)組氨酸 (His117 and His215)組成。此外,精氨酸殘基Arg80通過(guò)氫鍵與底物的羧基相互作用,是VlmB催化活性必不可少的關(guān)鍵氨基酸。隨后,研究人員還進(jìn)一步對(duì)其他氧化偶氮類分子(Elaiomycin和KA57-A)中VlmO/VlmB的同源蛋白的功能進(jìn)行了探究,結(jié)果顯示由VlmO/VlmB催化的酶促反應(yīng)序列可能是微生物中不對(duì)稱氧化偶氮類分子生物合成的保守策略(圖4)。
綜上,本研究發(fā)現(xiàn)了一種由兩個(gè)新型鐵離子依賴型酶家族共同催化的“hydrazine-azo-azoxy”的酶促反應(yīng)序列是微生物氧化偶氮類天然產(chǎn)物生物合成的保守策略。該研究成果不僅揭示了長(zhǎng)期以來(lái)氧化偶氮基團(tuán)生成的酶學(xué)基礎(chǔ),而且也為通過(guò)基因組挖掘方法精準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)該家族新活性化合物提供了基因標(biāo)記。
本文的共同第一作者為中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院周佳海課題組的臧鑫和浙江大學(xué)杜藝嶺課題組的史晶坤,通訊作者為周佳海和杜藝嶺研究員。該工作受到國(guó)家自然科學(xué)基金委項(xiàng)目(32122005)、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2019YFA09005000)和 深圳市科技項(xiàng)目(ZDSYS20210623091810032)的支持。VlmB與底物的復(fù)合物晶體衍射數(shù)據(jù)收集得到了上海光源和國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)研究(上海)設(shè)施生物大分子晶體學(xué)線站BL19U1工作人員的幫助。

圖1. 微生物中一種保守的氧化偶氮基團(tuán)的酶促合成策略
圖2. 部分含氮-氮(N-N)鍵類活性天然產(chǎn)物(a)及氧化偶氮家族化合物(b)
圖3. Valanimycin生物合成途徑中VlmO/VlmB參與的氧化偶氮基生成反應(yīng)
圖4. Elaiomycin和KA57-A生物合成途徑中的氧化偶氮基生成反應(yīng)
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