JACS|深圳先進院周佳海/浙大杜藝嶺組合作揭示微生物氧化偶氮類天然產物生物合成的酶學基礎
近日,中國科學院深圳先進技術研究院周佳海課題組和浙江大學杜藝嶺課題組和合作在JACS上發(fā)表了題為Conserved Enzymatic Cascade for Bacterial Azoxy Biosynthesis的研究論文。該研究揭示了微生物中氧化偶氮類天然產物關鍵結構基團生物合成的酶學基礎,發(fā)現(xiàn)了一個新穎的鐵離子依賴型膜結合氮-氮鍵合酶和一個雙鐵家族的氧化偶氮合酶。研究結果顯示由這兩個新家族金屬酶共同催化的酶促反應序列可能是細菌中不對稱氧化偶氮類天然產物生成的保守策略(圖1)。
氮-氮(N-N)鍵結構基團是眾多化學合成類藥物和活性天然產物的重要藥效團,其生物合成的酶促機理近年來獲得了極大關注(圖2a)。挖掘和研究含氮氮鍵天然產物生物合成途徑中負責氮-氮鍵合成的酶家族,可以為通過合成生物學技術實現(xiàn)眾多藥物的綠色制造提供理論指導和生物催化元件。氧化偶氮類(Azoxy)天然產物含有共同的官能團(RN = N+(O-)R),該家族化合物具有多樣化的結構和生活學活性,其中包括蘇鐵毒素cycasin、真菌抗生素calvatic acid、抗腫瘤和抗菌分子valanimycin、抗結核分子elaiomycin和殺線蟲分子jietacin等等(圖2b)。同時,氧化偶氮分子也已被鑒定為外源的肼或偶氮類異生物(如許多臨床藥物、食品或染料)在人體內生物轉化過程中產生的重要代謝中間產物,其在某些條件下可進一步轉化為具有致癌作用的重氮離子。盡管對于不對稱氧化偶氮類天然產物生物合成機理的研究已經經歷了數十年,但其關鍵氧化偶氮鍵基團形成的酶學基礎仍然是一個謎。
研究首先通過在大腸桿菌體系中部分重構valanimycin的生物合成途徑,揭示了膜蛋白VlmO能夠將一個不穩(wěn)定的酯中間體2轉化為含氮氮鍵的肼基產物4(圖3)。隨后,研究人員通過將化學合成的valanimycin生物合成基因簇導入底盤宿主Streptomyces albus J1074中,成功獲得了valanimycin的生產菌株。進一步通過體內基因敲除實驗驗證了vlmO基因對于valanimycin的生成是必不可少的?;谀そM分進行的體外生化實驗顯示VlmO催化氮氮鍵合成的反應活性依賴于金屬鐵離子,因此VlmO是一個新穎的鐵離子依賴型膜結合氮-氮鍵合酶。
接下來,研究人員進一步探索了valanimycin生物合成途徑中氮氮鍵形成之后的反應。研究發(fā)現(xiàn)基因簇上編碼的雙鐵金屬蛋白VlmB可以將肼基中間體4轉化為含氧化偶氮基的產物3(圖3)。厭氧條件下的反應和18O標記實驗揭示了氧化偶氮的氧原子來源于分子氧。有意思的是,VlmO催化的四電子氧化反應不需要提供外源的還原劑。UV-vis光譜學研究和厭氧條件下的中間體鑒定實驗顯示了肼基底物4可以提供電子還原VlmB的雙鐵中心來激活氧氣分子,肼基底物4自身則被氧化成偶氮中間體12,后者再經歷N-氧化反應生成valanimycin特征性的氧化偶氮基團。VlmB與底物的共晶結構顯示雙鐵中心由四個谷氨酸殘基 (Glu84, Glu114, Glu180, and Glu212)和兩個組氨酸 (His117 and His215)組成。此外,精氨酸殘基Arg80通過氫鍵與底物的羧基相互作用,是VlmB催化活性必不可少的關鍵氨基酸。隨后,研究人員還進一步對其他氧化偶氮類分子(Elaiomycin和KA57-A)中VlmO/VlmB的同源蛋白的功能進行了探究,結果顯示由VlmO/VlmB催化的酶促反應序列可能是微生物中不對稱氧化偶氮類分子生物合成的保守策略(圖4)。
綜上,本研究發(fā)現(xiàn)了一種由兩個新型鐵離子依賴型酶家族共同催化的“hydrazine-azo-azoxy”的酶促反應序列是微生物氧化偶氮類天然產物生物合成的保守策略。該研究成果不僅揭示了長期以來氧化偶氮基團生成的酶學基礎,而且也為通過基因組挖掘方法精準發(fā)現(xiàn)該家族新活性化合物提供了基因標記。
本文的共同第一作者為中國科學院深圳先進技術研究院周佳海課題組的臧鑫和浙江大學杜藝嶺課題組的史晶坤,通訊作者為周佳海和杜藝嶺研究員。該工作受到國家自然科學基金委項目(32122005)、國家重點研發(fā)計劃項目(2019YFA09005000)和 深圳市科技項目(ZDSYS20210623091810032)的支持。VlmB與底物的復合物晶體衍射數據收集得到了上海光源和國家蛋白質科學研究(上海)設施生物大分子晶體學線站BL19U1工作人員的幫助。

圖1. 微生物中一種保守的氧化偶氮基團的酶促合成策略
圖2. 部分含氮-氮(N-N)鍵類活性天然產物(a)及氧化偶氮家族化合物(b)
圖3. Valanimycin生物合成途徑中VlmO/VlmB參與的氧化偶氮基生成反應
圖4. Elaiomycin和KA57-A生物合成途徑中的氧化偶氮基生成反應
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