Metabolic Engineering | 羅小舟團(tuán)隊(duì)開發(fā)一鍋法選擇性生物合成Tyrian purple
11月22日,中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所羅小舟研究員團(tuán)隊(duì)在學(xué)術(shù)期刊Metabolic Engineering上發(fā)表了題為One-pot selective biosynthesis of Tyrian purple in Escherichia coli的文章。這項(xiàng)研究針對Tyrian purple在生產(chǎn)上面臨化學(xué)合成毒性大、海螺提取得率低及生物合成選擇性低等問題,研究團(tuán)隊(duì)提出了一種簡單的一鍋法選擇性生物合成Tyrian purple的方法,為Tyrian purple在天然染料及生物相容性半導(dǎo)體行業(yè)的規(guī)?;瘧?yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
Tyrian purple,中文名稱為骨螺紫、泰爾紫,主要由6,6'-二溴靛藍(lán)組成,是一種從海螺里提取的古老而珍貴的染料。它不僅被應(yīng)用在紡織品染色領(lǐng)域,而且在陶器、建筑和壁畫繪畫等相關(guān)領(lǐng)域得到了廣泛使用。在現(xiàn)代,Tyrian purple也很稀有,其售價(jià)高達(dá)4000美元/克(來源于Kremer)。根據(jù)市場調(diào)研公司Arizton的報(bào)告,2024年全球天然染料市場價(jià)值將達(dá)到50億美元,消費(fèi)者對天然染料染成的服裝需求不斷上升。同時(shí),研究表明這種昂貴的染料除了傳統(tǒng)用途之外還有其他用途,即其具有卓越的生物相容性半導(dǎo)體材料性能。它可被用于如染料敏化太陽能電池、功能聚合物薄膜材料和半導(dǎo)體材料等領(lǐng)域,具有廣闊的應(yīng)用前景(圖1)。
Tyrian purple的傳統(tǒng)制備工藝極其復(fù)雜,涉及到從骨螺類動(dòng)物的腺體中提取出一種分泌物,這種分泌物在氧化后會(huì)生成深紫色的染料。在18世紀(jì),制取1.4 g Tyrian purple需要 12000只骨螺作為原料,這個(gè)過程需要大量的工作和時(shí)間。此外,海螺類動(dòng)物利用色氨酸(Trp)合成Tyrian purple途徑中,負(fù)責(zé)合成Tyrian purple中間體的基因和酶尚未被完全闡明,且通過海螺類動(dòng)物的合成途徑中的溴代中間體合成Tyrian purple仍然需要至少四步酶催化。目前化學(xué)合成Tyrian purple的規(guī)模一直停留在少量分析或小規(guī)模制備。主要原因是大多數(shù)方法需要使用溴氣或氫溴酸進(jìn)行溴化,而這些方法缺乏區(qū)域選擇性,產(chǎn)率低且毒性大。而直接利用成本高昂的溴化前體開始合成也會(huì)限制Tyrian purple的大規(guī)模合成。因此,不論是利用傳統(tǒng)的海螺提取、海螺生物合成途徑還是化學(xué)合成的方法,目前均難以在工業(yè)上實(shí)現(xiàn)Tyrian purple的大規(guī)模生產(chǎn)。
近年來,研究人員利用微生物(如細(xì)菌或酵母等)細(xì)胞工廠進(jìn)行生物合成,以生產(chǎn)藥物、生物燃料和其他有價(jià)值的化學(xué)品。這種合成生物學(xué)的方法已成為從可再生底物中可持續(xù)生產(chǎn)Tyrian purple的替代方案。Byung-Gee Kim等研究人員提出在大腸桿菌(E. coli)中利用色氨酸6-鹵化酶,色氨酸酶和單加氧酶三步酶法從色氨酸合成Tyrian purple,這條Tyrian purple生物合成途徑較為簡單但面臨兩個(gè)很嚴(yán)重的問題,即色氨酸6-鹵化酶體內(nèi)催化色氨酸效率低和色氨酸酶對底物色氨酸和中間產(chǎn)物6-溴-色氨酸的催化缺乏選擇性。色氨酸酶會(huì)與色氨酸6-鹵化酶競爭底物,導(dǎo)致在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)合成只能獲得大量的靛藍(lán)副產(chǎn)物和極少的Tyrian purple。
為了克服上述問題,羅小舟研究員團(tuán)隊(duì)提出了利用來自Streptomyces toxytricini的色氨酸6-鹵化酶SttH、來自E. coli的色氨酸酶TnaA和來自Providencia Rettgeri GS-2菌中的吲哚氧化酶/還原酶GS-C和GS-D(GS-CD)從色氨酸合成Tyrian purple的方法。該團(tuán)隊(duì)首先對色氨酸6-鹵化酶進(jìn)行優(yōu)化。為了增強(qiáng)色氨酸6-鹵化酶(SttH)和來自E. coli的黃素還原酶(Fre)融合酶Fre-L3-SttH的可溶性表達(dá)及催化效率,該研究引入了GroEL/GroES分子伴侶系統(tǒng),同時(shí)優(yōu)化了表達(dá)載體,使Fre-L3-SttH融合酶的可溶性表達(dá)明顯增強(qiáng)。(圖2) 為了增強(qiáng)Fre-L3-SttH融合酶的體內(nèi)催化效率,該研究進(jìn)一步對培養(yǎng)基、鹵化物鹽和誘導(dǎo)劑的濃度進(jìn)行了優(yōu)化,使Fre-L3-SttH融合酶的體內(nèi)催化轉(zhuǎn)化率提升到了75%(圖3)。上述策略不僅為黃素依賴型色氨酸鹵化酶的體內(nèi)活性的增強(qiáng)提供了一種方法,也為Tyrian purple的生物合成奠定了基礎(chǔ)。
研究團(tuán)隊(duì)前期在Providencia Rettgeri GS-2菌中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的雙組分吲哚氧化酶GS-CD,其合成Tyrian purple的效果比之前報(bào)道的單加氧酶MaFMO和細(xì)胞色素P450酶CYP102G4更好。該研究還使用了一條剛性的短肽L3將色氨酸酶(TnaA)與GS-C的N端融合,獲得雙功能融合酶TnaA-L3-GS-C。基因GS-D被放置在GS-C的下游,由一個(gè)獨(dú)立的RBS控制其翻譯。TnaA-L3-GS-C+GS-D(TnaA-L3-GS-CD)體內(nèi)催化6-溴-色氨酸合成Tyrian purple的轉(zhuǎn)化率高達(dá)67.5%,可用于Tyrian purple的生物合成(圖4)。
為了實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌體內(nèi)通過一鍋法實(shí)現(xiàn)從Trp到Tyrian Purple的合成。研究人員將Fre-L3-SttH 和TnaA-L3-GS-CD與分子伴侶pGro7在大腸桿菌BL21(DE3) TnaA中進(jìn)行共表達(dá)(圖5a、b)。結(jié)果表明,在該體系中添加1000 M Trp 底物反應(yīng) 48 h 后,能產(chǎn)生 17.6 M(7.4 mg L-1)的Tyrian Purple(圖5d)。然而,靛藍(lán)仍然作為主要副產(chǎn)物存在,產(chǎn)量為 242.0 M(圖5d)。由于TnaA會(huì)與SttH競爭Trp底物,導(dǎo)致Tyrian Purple的產(chǎn)量較低。這成為在大腸桿菌中通過一鍋法從Trp生產(chǎn)Tyrian Purple的主要障礙。為了獲得更高的Tyrian Purple轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)生最少的靛藍(lán)副產(chǎn)物,有必要在時(shí)間上對TnaA與SttH這兩個(gè)酶催化反應(yīng)進(jìn)行分離。
為了克服選擇性問題,產(chǎn)生最少的靛藍(lán)副產(chǎn)物,該研究采用了 pL/pR-cI857熱誘導(dǎo)系統(tǒng)來精確調(diào)控TnaA-L3-GS-CD的表達(dá)。研究人員設(shè)計(jì)了一個(gè)三階段的培養(yǎng)及誘導(dǎo)過程,如圖6a所示:在30 C下的細(xì)胞生長階段,同時(shí)啟動(dòng)Fre-L3-SttH和分子伴侶groEL/groES的表達(dá)。此階段pL/pR啟動(dòng)子處于抑制狀態(tài),因此不能啟動(dòng)TnaA和GS-CD的表達(dá)。在42 C的熱誘導(dǎo)階段,當(dāng)溫度升至42 C,熱不穩(wěn)定的阻遏蛋白cI857被釋放并允許轉(zhuǎn)錄TnaA和GS-CD。隨后是溫度調(diào)回30 C的重組蛋白持續(xù)表達(dá)階段,此階段持續(xù)表達(dá)Fre-L3-SttH、TnaA和GS-CD。該研究通過優(yōu)化細(xì)胞生長時(shí)間及在42 C下的熱誘導(dǎo)時(shí)間,最終實(shí)現(xiàn)了從色氨酸選擇性生產(chǎn)Tyrian purple,產(chǎn)量為31.1 M(13.1 mg L-l)(圖6b和 6c)。然而,研究發(fā)現(xiàn)在最佳條件下,即使投喂充足的中間產(chǎn)物6-Br-Trp,熱誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控TnaA和GS-CD表達(dá)合成Tyrian purple的產(chǎn)量也只能達(dá)到20.4 M(圖6d),這表明熱誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中的pL/pR啟動(dòng)子應(yīng)該早于14小時(shí)開始啟動(dòng)。
為確保Fre-L3-SttH足夠高效從而允許pL/pR熱啟動(dòng)子提早啟動(dòng),該研究再次優(yōu)化了NaBr的添加濃度及補(bǔ)充酵母提取物來增強(qiáng)培養(yǎng)基營養(yǎng)。在最終添加150 mM NaBr的M9-Br-CAA培養(yǎng)基中添加0.1% 的酵母提取物,在30 C下反應(yīng)8小時(shí)后,該研究能夠從500 M色氨酸中選擇性地合成44.5 mg L-1的Tyrian Purple(圖7)。該研究為首次報(bào)道的通過一鍋法在E. coli中選擇性地合成Tyrian Purple,有助于降低Tyrian Purple的生物合成成本,為Tyrian Purple的大規(guī)模生產(chǎn)奠定一定的基礎(chǔ)。這種選擇性地一鍋法生物合成Tyrian purple的方法也為其它鹵代靛藍(lán)染料的生物合成提供了一種方法,這對于靛藍(lán)類染料用作細(xì)菌染料、生物相容性半導(dǎo)體材料以及抗菌涂層或材料具有重要意義。
中國科學(xué)院深圳先進(jìn)院合成生物學(xué)研究所研究員及內(nèi)蒙古大學(xué)客座博導(dǎo)羅小舟為本文的通訊作者,內(nèi)蒙古大學(xué)與中國科學(xué)院深圳先進(jìn)院聯(lián)培博士研究生李菲菲為本文的第一作者。該研究獲得國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金委、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金委、深圳市科技計(jì)劃等多個(gè)項(xiàng)目的支持,以及深圳市微生物藥物智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院和定量合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等平臺(tái)的支持。
圖1 Tyrian purple的應(yīng)用
圖2 優(yōu)化表達(dá)載體、分子伴侶和培養(yǎng)基以增強(qiáng)Fre-L3-SttH融合酶的可溶性表達(dá)及催化活性
a. Fre-L3-SttH融合酶在T7或BAD啟動(dòng)子控制下的表達(dá)載體優(yōu)化。b.不同構(gòu)建的Fre-L3-SttH的可溶性表達(dá)水平。箭頭分別指示Fre-L3-SttH(紅箭頭)和GroEL(橙箭頭)的表達(dá)。通M表示蛋白分子量標(biāo)記;T表示全菌;S表示上清。c. BAD-p15A和BAD-BBR1表達(dá)載體中Fre-L3-SttH融合酶與不同分子伴侶共表達(dá)的優(yōu)化。d.培養(yǎng)基的優(yōu)化
圖3 Fre-L3-SttH融合酶的體內(nèi)優(yōu)化
a. M9培養(yǎng)基組分的優(yōu)化。b. NaBr濃度的優(yōu)化。c. 誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化。
圖4 在大腸桿菌中從6-Br-Trp底物到Tyrian purple的轉(zhuǎn)化
a. 共表達(dá)TnaA和GS-CD或利用雙功能酶TnaA-L3-GS-CD時(shí),Tyrian purple的轉(zhuǎn)化率。 b. 體內(nèi)反應(yīng)中利用TnaA-L3-GS-CD 以6-Br-Trp為底物時(shí),Tyrian purple的轉(zhuǎn)化率
圖5 在大腸桿菌體內(nèi)通過一鍋法生物合成Tyrian Purple
a. 利用Fre-L3-SttH和TnaA-L3-GS-CD生物合成Tyrian Purple的示意圖。b. Fre-L3-SttH和TnaA-L3-GS-CD與分子伴侶groES/groEL在大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)的體系構(gòu)建示意圖。c. 6R-TnaA-L3-GS-CD 與分子伴侶groEL/groES共表達(dá)的體系構(gòu)建示意圖。d. 利用Fre-L3-SttH和TnaA-L3-GS-CD與分子伴侶groES/groEL共表達(dá)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行Tyrian Purple發(fā)酵48小時(shí)的結(jié)果。e. 利用Fre-L3-SttH和6R-TnaA-L3-GS-CD 與分子伴侶groEL/groES共表達(dá)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行Tyrian Purple發(fā)酵48小時(shí)的結(jié)果
圖6 利用熱調(diào)控體系選擇性地生物合成Tyrian purple
a. 利用熱調(diào)控體系調(diào)控TnaA-L3-GS-CD表達(dá)的過程。b. 細(xì)胞生長時(shí)間的優(yōu)化。c. 在42 C誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化。d. 在溫控誘導(dǎo)系統(tǒng)中通過投喂100-1000 M 6-Br-Trp底物反應(yīng)24小時(shí)后Tyrian purple的產(chǎn)量
圖7 獲得高純度的Tyrian purple
a. 不同濃度NaBr鹽濃度的優(yōu)化。 b.不同濃度的酵母提取物的優(yōu)化。c. Tyrian purple的產(chǎn)量:M9-Br-CAA培養(yǎng)基中添加150 mM NaBr和0.1%的酵母提取物,細(xì)胞生長時(shí)間為8小時(shí)。 d. 在100 mL帶擋板的玻璃錐形瓶中,使用25mL的反應(yīng)體系進(jìn)行Tyrian Purple發(fā)酵的結(jié)果
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