Cell Rep | 暢君雷/徐錦/Calvin Kuo合作報(bào)道成年小鼠腦血管血腦屏障功能的分子基礎(chǔ)
與外周血管相比,中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血管具有高度特化的解剖和功能特征,統(tǒng)稱為血腦屏障(Blood-Brain Barrier, BBB)。血腦屏障對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)、促使其行使正常神經(jīng)活動具有重要作用。近年來,血腦屏障功能紊亂被證明與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),包括阿爾茲海默癥、腦卒中及腦膠質(zhì)瘤等。血腦屏障結(jié)構(gòu)上由血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、胞外基底膜以及神經(jīng)細(xì)胞等構(gòu)成。其中,作為外周組織和血液成分進(jìn)入腦組織的第一道屏障,腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的各項(xiàng)生理特性對血腦屏障功能起主要的決定作用,然而決定這些生理特性的分子基礎(chǔ)尚不完全清楚。
近日,中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院暢君雷研究員、中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院徐錦教授和美國斯坦福大學(xué)Calvin J. Kuo教授合作,在Cell Reports期刊在線發(fā)表了題為Integrative multi-omic profiling of adult mouse brain endothelial cells and potential implications in Alzheimer’s disease的研究論文。研究人員利用多組學(xué)測序技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組及染色質(zhì)可及性等多個(gè)層面進(jìn)行整合分析,構(gòu)建了成年小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞全面的分子圖譜,并進(jìn)而鑒定了在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中選擇性富集的轉(zhuǎn)錄本、蛋白質(zhì)、順式調(diào)控元件(CREs)和轉(zhuǎn)錄因子(TFs),并分析了它們之間的相關(guān)性。該研究還進(jìn)一步鑒定了小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞富集蛋白和轉(zhuǎn)錄因子在正常人類腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中的保守性,以及其表達(dá)水平在阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease,AD)小鼠模型中發(fā)生的變化。
首先,研究人員基于流式分選技術(shù)分離得到高純度的成年小鼠腦組織及外周組織(肝臟、肺臟)的血管內(nèi)皮細(xì)胞。利用轉(zhuǎn)錄組測序和定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(DIA-MS),研究人員鑒定了相較于外周組織血管內(nèi)皮細(xì)胞,在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中選擇性富集的轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì),并分析了它們的相關(guān)性。結(jié)果表明,在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中選擇性富集的轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)之間存在部分但顯著的非相關(guān)性,最富集的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本中僅有約10%在蛋白質(zhì)水平上也顯著富集,而許多腦血管內(nèi)皮細(xì)胞富集的轉(zhuǎn)錄本編碼的蛋白質(zhì)未被檢測到。另一方面,在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中選擇性富集的蛋白質(zhì)中約有50%的轉(zhuǎn)錄本水平與外周血管內(nèi)皮細(xì)胞中該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本水平?jīng)]有顯著差異。這些結(jié)果表明,獲得基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的信息而不僅僅依賴其轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平,對于研究基因在血腦屏障中的功能以及充分了解血腦屏障如何形成、維持和調(diào)節(jié)十分重要。
其次,研究人員還利用ATAC-seq分析鑒定了在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性開放的染色質(zhì)區(qū)域,并利用轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合motifs進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn),來自TCF/LEF、SOX和ETS轉(zhuǎn)錄因子家族的motifs在小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞染色質(zhì)特異性開放區(qū)域中顯著富集。結(jié)合上述的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù),研究人員進(jìn)一步確定了轉(zhuǎn)錄因子LEF1、SOX17和ERG可能獨(dú)立或合作調(diào)節(jié)血腦屏障功能基因的表達(dá),對血腦屏障功能起主要的調(diào)控作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究腦血管血腦屏障功能的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。
鑒于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞富集蛋白質(zhì)的水平與其轉(zhuǎn)錄本水平顯著的非相關(guān)性,研究人員隨后專注于驗(yàn)證之前未報(bào)道過的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞富集蛋白質(zhì)。通過全面的篩選和特異性驗(yàn)證,研究人員找到了有良好表現(xiàn)、高特異性的免疫熒光染色抗體,從而鑒定了8個(gè)蛋白(AFAP1L2, CGNL1, EPS8L2, IGF1R, PALMD, PDXK, SORBS2和TPD52)和轉(zhuǎn)錄因子LEF1、SOX17和ERG在成年小鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá),并證明了它們在正常成年人類腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中同樣高表達(dá),表明小鼠和人類腦血管內(nèi)皮細(xì)胞血腦屏障的分子特征有很高的相似性。
最后,為了鑒定這些腦血管內(nèi)皮細(xì)胞富集蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的潛在作用、進(jìn)一步表征血腦屏障的疾病相關(guān)分子特征,研究人員在AD小鼠模型5xFAD小鼠及其同窩對照小鼠(9月齡,雄性)中檢測了上述富集蛋白及轉(zhuǎn)錄因子在疾病發(fā)生后的變化。研究結(jié)果表明,富集蛋白AFAP1L2、EPS8L2、IGF1R以及轉(zhuǎn)錄因子LEF1在5xFAD小鼠大腦海馬組織腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)生了顯著下調(diào),而其他富集蛋白和轉(zhuǎn)錄因子在5xFAD小鼠中沒有明顯變化。
綜上,該研究在轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組及染色質(zhì)可及性等多個(gè)層面構(gòu)建了成年小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的分子圖譜,鑒定了在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中選擇性富集的轉(zhuǎn)錄本、蛋白質(zhì)、順式調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子,驗(yàn)證了小鼠和人類腦血管血腦屏障分子特征的相似性,并揭示了AD條件下血腦屏障新的分子病理表征。該研究為全面理解腦血管血腦屏障功能的分子機(jī)理奠定了研究基礎(chǔ),并為進(jìn)一步的血腦屏障功能研究和疾病干預(yù)提供了理論依據(jù)和候選靶點(diǎn)。
中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院助理研究員余敏、中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院博士生聶雅閣、中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生楊嘉文及中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院助理研究員楊時(shí)倫為論文的共同第一作者。中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院暢君雷研究員、中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院徐錦教授、美國斯坦福大學(xué)Calvin J. Kuo教授為論文的共同通訊作者。研究還得到了美國斯坦福大學(xué)的Howard Y. Chang教授團(tuán)隊(duì)和Michael P. Snyder教授團(tuán)隊(duì)、鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的郭付有教授及其團(tuán)隊(duì)成員宋登攀的重要幫助和指導(dǎo)。本研究獲得了國家自然科學(xué)基金委、科技部、廣東省、深圳市、中科院、香港裘槎基金會以及廣東省腦血管病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)創(chuàng)新平臺等各方的資助。
圖1. 小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性富集轉(zhuǎn)錄本與蛋白質(zhì)相關(guān)性分析
圖2. 研究的整體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和思路
(暢君雷課題組長期聚焦于研究腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制和靶向干預(yù)新策略開發(fā),尤其關(guān)注血腦屏障功能形成、維持與紊亂的分子調(diào)控機(jī)制和生理病理作用,旨在為腦血管疾病及相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療提供新的思路和干預(yù)靶點(diǎn),部分研究成果已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。若有意向開展學(xué)術(shù)合作或加入本團(tuán)隊(duì)共同開展本方向研究,請聯(lián)系:jl.chang@siat.ac.cn)
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