Metab. Eng.|系統(tǒng)改造釀酒酵母細(xì)胞壁生物合成途徑增強(qiáng)重組酶的胞外分泌和表面展示
4月24日,中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所Jay Keasling團(tuán)隊湯紅婷副研究員與羅小舟研究員團(tuán)隊合作在Metabolic Engineering上發(fā)表了題為《Systematic genetic modifications of cell wall biosynthesis enhanced the secretion and surface-display of polysaccharide degrading enzymes in Saccharomyces cerevisiae》的研究成果。在該工作中,研究人員基于合成生物學(xué)策略,系統(tǒng)性地探究釀酒酵母細(xì)胞壁生物合成途徑中關(guān)鍵基因?qū)Ψ置诤捅砻嬲故?/span>BGL1酶活性的影響,篩選能夠提高重組酶活性的新基因改造靶點(diǎn),進(jìn)而組合改造新基因靶點(diǎn),進(jìn)一步提高了重組酶的活性。同時,該研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)和逆向工程分析發(fā)現(xiàn),參與蛋白翻譯和分泌途徑的關(guān)鍵基因上調(diào)表達(dá)對提高重組酶分泌和表面展示活性具有重要作用。這項研究為構(gòu)建酵母細(xì)胞工廠高效分泌和展示重組蛋白提供了新思路。本文的第一作者為研究助理陳南柱、碩士學(xué)生楊碩和研究助理尤大偉,湯紅婷副研究員和羅小舟研究員為論文通訊作者。

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文章鏈接:https://doi.org/10.1016/j.ymben.2023.04.011
利用農(nóng)業(yè)廢棄物等廉價碳源生產(chǎn)生物能源、天然產(chǎn)物、大宗化學(xué)品等具有附加價值的化學(xué)物質(zhì)是有助于實現(xiàn)“碳中和”的工業(yè)生產(chǎn)策略。纖維素、淀粉等多糖是重要成分,但由于生物利用過程的效率限制,往往導(dǎo)致其不能被充分利用。釀酒酵母作為傳統(tǒng)的模式真核生物,常用于分泌表達(dá)或表面展示具有不同功能的蛋白,其中其胞外表達(dá)纖維素酶、淀粉酶等多糖水解酶,可以將這些廉價碳源通過生物統(tǒng)合加工過程(Consolidated Bioprocess, CBP)轉(zhuǎn)化為高附加值產(chǎn)品。改造釀酒酵母分泌途徑(secretory pathway)提高重組蛋白胞外產(chǎn)量是眾所周知的方案之一。而細(xì)胞壁生物合成過程緊密地調(diào)控蛋白分泌途徑,然而,它對重組蛋白胞外表達(dá)活性的影響卻較少被報道。
在本研究中,作者首先選取來自Saccharomycopsis fibuligera的β葡萄糖苷酶(β-glucosidase, BGL1)作為報告蛋白,以其分泌(secretion, sBGL1)和表面展示表達(dá)的活性(surface-display, dBGL1)作為指標(biāo),系統(tǒng)性地評估了79個參與細(xì)胞壁合成基因的敲除對sBGL1和dBGL1活性的影響。經(jīng)過96深孔板培養(yǎng)篩選以及搖瓶發(fā)酵二次驗證后發(fā)現(xiàn),DFG5、YPK1、FYV5以及CCW12或KRE1基因的失活,能夠顯著提高sBGL1或dBGL1的活性(>40%)(圖1)。
圖1. 細(xì)胞壁生物合成基因失活對BGL1活性的影響。
隨后,為了進(jìn)一步探究上述基因的改造是否存在組合效應(yīng),該研究對上述基因靶點(diǎn)進(jìn)行組合敲除,包括雙敲除,三敲除和四敲除。通過分析其對分泌和表面展示BGL1活性的影響發(fā)現(xiàn),FYV5和CCW12雙敲除菌株表現(xiàn)出最優(yōu)的BGL1胞外表達(dá)能力,其sBGL1和dBGL1活性相較野生型菌株分別提升了4.41和5.14倍(圖2)。

圖2. 細(xì)胞壁生物合成的組合改造進(jìn)一步提高sBGL1(a)和dBGL1(b)的活性
一般,富營養(yǎng)培養(yǎng)基YP對蛋白胞外表達(dá)具有促進(jìn)作用,因此,該研究也測試了FYV5和CCW12雙敲除菌株在YP條件下重組酶胞外表達(dá)活性的變化。結(jié)果顯示,在YP中sBGL1和dBGL1活性分別提升了31.68%和46.55%。

圖3. 富培養(yǎng)基YP使ΔFYV5ΔCCW12菌株分泌和表面顯示BGL1活性進(jìn)一步增強(qiáng)。
為了驗證改造細(xì)胞壁合成途徑具有普適性,該研究測試了FYV5和CCW12雙敲除對不同錨定蛋白(Sed1p, Dan4p, Aga1p)和不同重組酶的影響。研究結(jié)果顯示,FYV5和CCW12雙敲除能提高使用不同錨定蛋白的BGL1活性,也能促進(jìn)使用同一錨定蛋白的不同重組酶的活性(圖4),包括纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase, CBH1)和淀粉酶(Amylase)。

圖4. 細(xì)胞壁生物合成改造后的菌株提升不同重組酶的活性
為了探究FYV5和CCW12雙敲除菌株提升重組酶胞外表達(dá)的潛在機(jī)制,該研究對改造菌株和野生型菌株進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)測試,發(fā)現(xiàn)FYV5和CCW12雙敲除能引發(fā)系列蛋白的上調(diào)表達(dá),除了分泌途徑關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工過程(protein processing in the ER),蛋白翻譯(protein processing in the ER and protein translation)過程也是主要的被調(diào)控模塊之一(圖5)。通過逆向代謝工程研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)12個蛋白翻譯過程的蛋白,能提高BGL1胞外活性,其中,過表達(dá)RPL8B、DBP1、TIF3、ETT1和SUI3能將BGL1活性分別提高6.8、2.7、1.7、1.2和1.1倍(圖5c)。

圖5. 通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析和逆向代謝工程揭示改造細(xì)胞壁生物合成途徑提高重組酶活性的機(jī)制。
綜上所述,研究人員系統(tǒng)地探究釀酒酵母細(xì)胞壁生物合成途徑對重組蛋白胞外表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)數(shù)個新的靶點(diǎn)的改造能顯著提高重組酶胞外酶活,包括DFG5、YPK1、FYV5、CCW12和KRE1。通過特定基因的組合改造和培養(yǎng)基的優(yōu)化,使釀酒酵母胞外表達(dá)重組酶分泌和展示活性得到了大幅度的增強(qiáng),分別提高了6.13倍和7.99倍。最后,通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析偶聯(lián)逆向工程策略,揭示蛋白翻譯過程是改造菌株高效表達(dá)重組酶的重要調(diào)控之一。這項研究為高效構(gòu)建酵母細(xì)胞工廠提供了新思路。
致謝
這項工作得到了國家自然科學(xué)基金(31901030)、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金(2021A1515010842)及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院的支持。同時,研究人員對深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成基因組學(xué)中心戴俊彪客座研究員提供的酵母敲除菌株庫致以誠摯的感謝。
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