Microbiology Spectrum | 檢測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的新方法
中科院深圳先進(jìn)院合成所助理研究員倪磊、研究員金帆為共同通訊作者。

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文章鏈接:https://doi.org/10.1128/spectrum.03783-22
轉(zhuǎn)錄因子能夠以特定序列與基因?qū)R恍越Y(jié)合,保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間空間表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子和DNA的相互作用在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(GRNs)中起著核心作用。目前檢測轉(zhuǎn)錄因子-DNA結(jié)合特異性的主要方法需要先對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA片段進(jìn)行捕獲富集然后再進(jìn)行測序(或其他分析),如染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP)、配體系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集(SELEX)和DNA親和純化測序(DAP-Seq)等。這些方法涉及復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)程序,如基因組DNA的碎片化和擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄因子的免疫沉淀等,較高的操作門檻不利于新手或跨學(xué)科人員快速展開實(shí)驗(yàn)。
在本研究中,金帆團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種名為AIDmut-Seq的體內(nèi)方法?;罨T導(dǎo)胞苷脫氨酶(AID)可以將單鏈DNA序列中的堿基C脫氨化形成堿基U, DNA復(fù)制后發(fā)生C-T或G-A替代。研究人員將AID融合到轉(zhuǎn)錄因子上,并在體內(nèi)誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),這樣就可以在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)附近引入突變,后續(xù)可以通過全基因組測序直接檢測。由于不需要對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的片段進(jìn)行捕獲富集,而僅需對突變標(biāo)記進(jìn)行測序,因此AIDmut-Seq的整個(gè)工作流程僅包含細(xì)菌培養(yǎng)、基因組提取和生信分析三個(gè)步驟(圖 1),不涉及其他復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)操作,大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)人員的時(shí)間和勞動(dòng)成本。

圖1 AIDmut-Seq的原理和步驟
研究人員使用不同類型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子對AIDmut-Seq進(jìn)行了驗(yàn)證,表明該方法對大多數(shù)轉(zhuǎn)錄激活因子(如LasR,F(xiàn)leQ,ErdR,GacA,ExsA等)的具有較高效率。而對一些小的轉(zhuǎn)錄抑制因子(如RsaL和AmrZ等)雖然表現(xiàn)出較低的效率,但通過該方法計(jì)算得到的轉(zhuǎn)錄因子識別基序(motif)和現(xiàn)有方法得到的基序具有很大相似性。此外,使用AIDmut-Seq還得到了許多之前沒有發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和新的調(diào)節(jié)模式。這些結(jié)果證明了AIDmut-Seq的高效性和泛用性,可以作為現(xiàn)有方法的重要補(bǔ)充工具(圖2)。

圖2 AIDmut-Seq適用于大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子
研究人員將ADImut-Seq與目前最常用的ChIP-seq進(jìn)行了“標(biāo)桿測試”(benchmarking)。比較發(fā)現(xiàn), AIDmut-Seq和ChIP-seq對TFBS具有相似的檢測精度,但AIDmut-seq具有更窄的檢測窗口。尤其對于啟動(dòng)子上存在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的位置,AIDmut-Seq相比ChIP-seq具有更好的分辨率,因此AIDmut-Seq在識別同一啟動(dòng)子中的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)具有潛在的優(yōu)勢(圖3)。

圖3 AIDmut-Seq與ChIP-seq的比較
該研究得到了科技部重大研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、中國科學(xué)院科學(xué)儀器開發(fā)和深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院等項(xiàng)目支持。
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