Nucleic Acids Research | 底盤噬菌體的高通量制備
北京時間12月14日,中國科學院深圳先進技術(shù)研究院馬迎飛團隊在國際學術(shù)期刊《核酸研究》(Nucleic Acids Research,IF=19))上發(fā)表了題為Genome-scale top-down strategy to generate viable genome-reduced phages的文章。該工作報道了一種高通量制備底盤噬菌體的方法,在鑒定噬菌體非必需基因的同時,獲得底盤噬菌體,并得到比野生型噬菌體侵染能力更強的基因組簡化噬菌體,在噬菌體治療和噬菌體合成生物學中具有巨大的潛在價值。
深圳先進技術(shù)研究院馬迎飛研究員為該文章的通訊作者,其博士生袁盛建為文章第一作者。
文章上線截圖
噬菌體是一種病毒,能夠侵染并殺死細菌。因此,噬菌體在被發(fā)現(xiàn)伊始就被用來對抗細菌感染。2020年,馬迎飛團隊成功聯(lián)合深圳人民醫(yī)院開展了深圳市第一例應(yīng)用噬菌體治療耐藥鮑曼不動桿菌肺部感染的臨床試驗。噬菌體是地球上多樣性最高和最豐富的生物體,也是合成生物學研究中重要的模式生物。底盤噬菌體通過刪除基因組上的冗余基因,可以擴大噬菌體顆粒的DNA包裝空間,搭載更多的功能基因,增強其在各種生物工程應(yīng)用中的抗菌活性和潛力,同時增加對噬菌體的理解。
目前,如何高通量刪除噬菌體冗余基因?qū)蒲腥藛T來說仍然具有挑戰(zhàn)性。第一個挑戰(zhàn)是怎樣能夠高通量識別噬菌體的非必需基因?因四分之三的噬菌體基因組無法找到其同源序列,使其不能通過信息分析進行非必需基因判斷。第二個挑戰(zhàn)是怎樣篩選具有生長優(yōu)勢的突變噬菌體?有些噬菌體基因刪除并不會使噬菌體“死亡”,但刪除會嚴重影響噬菌體的擴增(準必需基因)。另外第三個挑戰(zhàn)是如何在逐刪除基因組不同區(qū)域這種費力且耗時的情況下,同時篩選能夠維持穩(wěn)健生長的突變噬菌體?
CiPGr方法的開發(fā)
CRISPR是細菌對抗噬菌體的防御系統(tǒng),當噬菌體侵染的細菌含有人工設(shè)計的CRISPR系統(tǒng)時,就有一定概率可以刪除噬菌體的某個基因(突變株1)。如果用突變株1侵染含有另一個人工設(shè)計的CRISPR系統(tǒng)宿主菌時,就有一定概率可以刪除噬菌體的另一個基因(突變株2),這樣持續(xù)下去,就有能得到一個底盤噬菌體(圖1)??蒲袌F隊猜想,是否可以把所有的含有不同人工設(shè)計的CRISPR系統(tǒng)宿主菌混合在一起,讓噬菌體基因高通量刪除并通過優(yōu)勝劣汰篩選出侵染能力強的突變株呢?
基于這個啟發(fā),團隊開發(fā)了一種自上而下的全基因組簡化方法,稱為基于CRISPR-Cas9的迭代噬菌體基因組簡化方法(CRISPR/Cas9-based iterative phage genome reduction, CiPGr)。針對所有目標基因,設(shè)計不同的CRISPR系統(tǒng),并在DNA芯片上合成,制備出刪除噬菌體不同基因的CRISPR細菌文庫。在CiPGr過程中,用一群噬菌體侵染細菌文庫,使不同的噬菌體刪除不同的基因,形成一個噬菌體突變文庫。如果被刪除的基因?qū)κ删w擴增不是必需的,則突變噬菌體后代可以繼續(xù)侵染新的細菌。噬菌體突變文庫不斷轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)的細菌文庫中,使得基因缺失在噬菌體基因組中不斷積累,而具有生長優(yōu)勢的基因組簡化噬菌體將在種群中占主導地位,最終被富集并更可能被分離純化出來(圖2)。
非必需基因的鑒定
團隊使用CiPGr成功簡化了四種不同的有尾噬菌體(T7、T4、seszw和selz)基因組,得到了它們的底盤噬菌體、非必需基因集以及比野生型侵染能力更強的基因組簡化噬菌體。
對獲得的噬菌體突變文庫進行二代基因組測序,團隊通過生物信息分析,即可操作簡單、高效率的獲得到噬菌體的可刪除基因集??蓜h除基因集中的基因數(shù)量在4個不同噬菌體中,占總基因數(shù)的50%左右。團隊根據(jù)實驗結(jié)果將噬菌體基因分為三類:(1)非必需基因:噬菌體突變文庫中的刪除豐度>5%的基因,這些基因在分離的60個單克隆突變噬菌體基因組中沒有被刪除;(2)準必需基因:噬菌體突變文庫中刪除豐度<5%基因,這些基因的刪除嚴重影響了噬菌體的擴增,導致在連續(xù)轉(zhuǎn)接過程中,種群中相應(yīng)突變體的快速淘汰;(3)必需基因:在可刪除基因集中未檢測到的基因(圖3)。
最佳裂解能力簡化噬菌體鑒定
在對突變噬菌體的表型進行鑒定時,團隊發(fā)現(xiàn)部分突變株的抑菌或殺菌能力比野生型強,因此,科研人員設(shè)計了實驗對這些更強殺菌能力的突變株進行分離與鑒定,并將獲得的噬菌體突變文庫與野生型宿主菌混合在一起進行培養(yǎng)。經(jīng)過8次連續(xù)轉(zhuǎn)接后,具有較高侵染效率的突變株能產(chǎn)生更多子代,使其在種群中占主導地位,從而分離出強殺菌能力的簡化基因組噬菌體。其中T4、seszw和selz的殺死同樣數(shù)量細菌的時間比野生型減少了一半以上(圖4),由此說明通過基因組簡化可以獲得比野生型噬菌體裂解能力更強突變株的可行性。
最簡化基因組噬菌體篩選
在對CiPGr生成的單克隆突變噬菌體進行測序時,科研團隊觀察到基因缺失數(shù)量隨著轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加而在單克隆突變噬菌體基因組中不斷積累。CiPGr應(yīng)用于四種不同的有尾噬菌體(模式噬菌體T7和T4;沙門氏菌噬菌體seszw和selz),導致這些噬菌體的突變體刪除8-23%(3.3-35 kbp)的序列,產(chǎn)生了最簡底盤噬菌體。持續(xù)的轉(zhuǎn)接過程使具有較大生長優(yōu)勢的突變株將在突變庫中占主導地位,并在眾多突變株中有更大概率進入下一輪轉(zhuǎn)接過程。因此,單克隆突變噬菌體基因組中基因刪除的順序可能表明這些基因在噬菌體擴增中的重要性順序,即基因越早被刪除,該基因?qū)κ删w擴增就越不重要(圖5)。
在CiPGr的操作過程中,研究團隊只需要獲得噬菌體基因組序列,就能夠?qū)⒃摲椒ㄝp松推廣至其他野生型噬菌體而不需要其他先驗的知識。同時,這些簡化噬菌體能夠整合更多的基因元件以增強噬菌體的功能,在噬菌體治療中具有巨大的應(yīng)用潛力。此外,噬菌體基因組中必需、非必要和準必需基因的鑒定對于噬菌體基因組的重新設(shè)計和噬菌體生物學的研究具有重大意義。
該研究得到了科技部重點研發(fā)計劃、中科院先導B、中科院定量工程生物學重點實驗室、廣東省合成基因組學重點實驗室及深圳合成生物學創(chuàng)新研究院的資助。
參考文獻
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圖1 噬菌體基因連續(xù)刪除示意圖

圖2 實驗流程設(shè)計

圖3 噬菌體的基因刪除與分類

圖4 比野生型噬菌體更強突變株的篩選(A)和鑒定(B)

圖5 單克隆突變噬菌體的基因刪除
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