Nature Communications | 趙國(guó)屏-趙維團(tuán)隊(duì)報(bào)道腳手架蛋白相分離調(diào)控微生物細(xì)胞極性
細(xì)胞不對(duì)稱性(也叫細(xì)胞極性)廣泛存在于動(dòng)植物和微生物細(xì)胞中,其基本特征在于母細(xì)胞在分裂前發(fā)生細(xì)胞極化,從而不對(duì)稱分裂生成兩個(gè)不同命運(yùn)的子代細(xì)胞。細(xì)胞極性是生命世界產(chǎn)生多樣性的根本原因,在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、發(fā)育和行使細(xì)胞功能等多個(gè)方面發(fā)揮重要作用。細(xì)胞極性紊亂是某些腫瘤(如皮膚癌)發(fā)生的重要表現(xiàn);在微生物中,細(xì)胞極性會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞異質(zhì)性,造成病原菌抗性耐受(如結(jié)核分枝桿菌)、環(huán)境抵抗或宿主免疫逃逸等。
然而,由于細(xì)胞命運(yùn)決定調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的高度復(fù)雜性,目前我們對(duì)細(xì)胞極性的理解仍處于初級(jí)階段。細(xì)胞命運(yùn)決定蛋白如何實(shí)現(xiàn)時(shí)空有序的不對(duì)稱性亞細(xì)胞定位,是該領(lǐng)域有待深入解析的核心問(wèn)題。微生物新月柄桿菌作為細(xì)胞不對(duì)稱性分裂的精煉模型,在細(xì)胞極性研究中有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

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腳手架蛋白廣泛存在于細(xì)胞中,通常能自組裝形成大分子復(fù)合物并將客戶蛋白招募至特定的細(xì)胞區(qū)域,在包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂、形態(tài)發(fā)生和不對(duì)稱分裂等生物過(guò)程中發(fā)揮作用。在果蠅和隱桿線蟲(chóng)中,已發(fā)現(xiàn)Par蛋白可以通過(guò)相分離形成無(wú)膜區(qū)室,使下游信號(hào)蛋白(如αPKC或PKC3)不對(duì)稱定位和分布,從而保證了胚胎發(fā)育的正常進(jìn)行[1]。這引起了研究團(tuán)隊(duì)關(guān)于微生物腳手架蛋白可能通過(guò)發(fā)生相分離來(lái)調(diào)控細(xì)胞極性的思考。
研究團(tuán)隊(duì)以細(xì)胞發(fā)育模式微生物——新月柄桿菌為研究對(duì)象。在每個(gè)細(xì)胞周期中,新月柄桿菌可不對(duì)稱性分裂產(chǎn)生一個(gè)帶鞭毛的游動(dòng)子細(xì)胞和一個(gè)有柄子細(xì)胞(圖1)。在細(xì)胞分裂前,一對(duì)細(xì)胞命運(yùn)決定蛋白(磷酸化酶PleC和蛋白激酶DivJ)的極性定位協(xié)同調(diào)節(jié)了多個(gè)下游信號(hào)蛋白的磷酸化水平,并決定了新月柄桿菌的細(xì)胞命運(yùn)。已有研究表明,蛋白激酶DivJ通過(guò)PopZ和SpmX這一對(duì)腳手架蛋白復(fù)合物被招募到舊細(xì)胞極[2]。而研究團(tuán)隊(duì)前期工作發(fā)現(xiàn)磷酸化酶PleC被一個(gè)潛在的腳手架蛋白PodJ定位到新細(xì)胞極[3]。然而,微生物腳手架蛋白如何招募細(xì)胞命運(yùn)決定因子進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞極性的作用機(jī)制尚不清楚。為此,研究團(tuán)隊(duì)以PodJ蛋白為中心,在新月柄桿菌中開(kāi)展了細(xì)胞極性建立和調(diào)控機(jī)制的探索。

圖1. 新月柄桿菌細(xì)胞周期
一、證明極性蛋白PodJ為腳手架蛋白并具有相分離能力
首先,研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)活細(xì)胞延時(shí)攝影證實(shí)了PodJ的細(xì)胞極定位模式:PodJ特異性地識(shí)別并聚集在新月柄桿菌的細(xì)胞新極。同時(shí),PodJ能夠在“遠(yuǎn)親”大腸桿菌中表達(dá)并進(jìn)行細(xì)胞極性定位。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)分析蛋白聚態(tài)特征發(fā)現(xiàn),該蛋白可以在體外自發(fā)形成大分子的高聚物。而且,PodJ在新月柄桿菌和大腸桿菌中的極性聚集都不依賴其他腳手架蛋白,表明該蛋白是一種能自組裝的腳手架蛋白。
對(duì)PodJ蛋白序列分析,研究團(tuán)隊(duì)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)PodJ具有典型的內(nèi)在無(wú)序蛋白序列(Intrinsically Disordered Region, IDR)和串聯(lián)重復(fù)序列,暗示了該蛋白發(fā)生相分離的潛在可能。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),內(nèi)源生理蛋白水平的PodJ可在體外自發(fā)形成了微米大小的球形液滴。同時(shí),PodJ在細(xì)胞內(nèi)也可形成具有典型流動(dòng)性液滴性質(zhì)的蛋白凝聚體(圖2),說(shuō)明其在體內(nèi)外均可發(fā)生相分離。

圖2. 腳手架蛋白PodJ相分離。a. PodJ在體外發(fā)生相分離形成蛋白液滴;b. PodJ蛋白液滴的融合特性分析;c. PodJ蛋白液滴的流動(dòng)性分析;d. 鹽離子濃度及蛋白濃度對(duì)PodJ相分離的影響;e-f. PodJ細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相分離及流動(dòng)性分析。
二、腳手架蛋白PodJ相分離有重要的生理功能
通過(guò)大腸桿菌異源共表達(dá)平臺(tái),研究團(tuán)隊(duì)從23個(gè)新月柄桿菌細(xì)胞周期或極性相關(guān)蛋白中,篩選出了兩個(gè)新的被PodJ所招募的細(xì)胞信號(hào)蛋白,即纖毛蛋白CpaE和鞭毛蛋白FliG。在新月柄桿菌中的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)表明,PodJ對(duì)PleC、CpaE和FliG等細(xì)胞信號(hào)功能蛋白的特異性招募都發(fā)生在細(xì)胞新極(圖3)。這些結(jié)果說(shuō)明,腳手架蛋白PodJ可能通過(guò)相分離實(shí)現(xiàn)細(xì)胞區(qū)室化,并招募細(xì)胞新極相關(guān)的信號(hào)功能蛋白。

圖 3. PodJ細(xì)胞區(qū)室化的生理功能。a-b. 在大腸桿菌中篩選與PodJ相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)蛋白;c.在新月柄桿菌中驗(yàn)證PodJ招募相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)蛋白;d. PodJ招募細(xì)胞信號(hào)蛋白模式圖;e. PodJ通過(guò)相分離招募細(xì)胞信號(hào)蛋白。
進(jìn)一步,研究團(tuán)隊(duì)對(duì)PodJ蛋白的結(jié)構(gòu)和功能域進(jìn)行了深入挖掘和表征。研究發(fā)現(xiàn),PodJ蛋白的IDR和CC4-6兩個(gè)結(jié)構(gòu)域都可以介導(dǎo)體外相分離發(fā)生。為了更好地了解體內(nèi)PodJ相分離的結(jié)構(gòu)域,研究團(tuán)隊(duì)在大腸桿菌中表達(dá)了多個(gè)PodJ蛋白變體,觀察其在細(xì)胞內(nèi)的蛋白定位和積累情況,并使用FRAP分析了其流動(dòng)性。結(jié)果顯示,僅有CC4-6能夠形成細(xì)胞區(qū)室化并展現(xiàn)出一定的流動(dòng)性。這些結(jié)果說(shuō)明,CC4-6或IDR均可在體外驅(qū)動(dòng)PodJ 相分離,而在細(xì)胞內(nèi),PodJ相分離可能依賴于CC4-6和IDR共同起作用。通過(guò)在大腸桿菌中共表達(dá)信號(hào)功能蛋白和PodJ變體蛋白,發(fā)現(xiàn)IDR負(fù)責(zé)PleC和CpaE的招募,而CC4-6負(fù)責(zé)與FliG的相互作用。PodJ的體外相分離試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)(圖3)。這些結(jié)果說(shuō)明,PodJ驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞區(qū)室化可能直接介導(dǎo)了對(duì)細(xì)胞信號(hào)功能蛋白的招募,從而在細(xì)胞新極的組織和構(gòu)建過(guò)程中發(fā)揮作用。
三、揭示對(duì)腳手架蛋白PodJ相分離的調(diào)控機(jī)制
在真核細(xì)胞中,不對(duì)稱分配復(fù)合物之間往往存在著相互的抑制性調(diào)節(jié),這對(duì)于細(xì)胞極性的穩(wěn)態(tài)建立同樣至關(guān)重要。研究團(tuán)隊(duì)推測(cè),原核細(xì)胞中的細(xì)胞極性調(diào)控可能也存在著類似機(jī)制。為此,研究團(tuán)隊(duì)從11個(gè)新月柄桿菌極性蛋白中,篩選到一個(gè)細(xì)胞舊極腳手架蛋白SpmX,發(fā)現(xiàn)其調(diào)節(jié)了PodJ在大腸桿菌的極性積累。在新月柄桿菌中,SpmX的存在負(fù)調(diào)節(jié)了PodJ細(xì)胞區(qū)室化形成。進(jìn)一步在體外進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),SpmX不僅可以直接抑制PodJ液滴的形成,并且可以覆蓋在PodJ液滴的表面,從而抑制液滴的生長(zhǎng)并加速液滴的老化,造成對(duì)PodJ凝聚體動(dòng)力學(xué)和穩(wěn)定性的損害(圖4)。這些體外和體內(nèi)觀察結(jié)果表明,新月柄桿菌的新、舊細(xì)胞極重塑可能是由SpmX對(duì)PodJ相分離的抑制性調(diào)控作用所驅(qū)動(dòng)的。

圖 4. SpmX負(fù)調(diào)控PodJ相分離。a. 新月柄桿菌細(xì)胞新、舊極重構(gòu)示意圖;b. SpmX負(fù)調(diào)控PodJ細(xì)胞區(qū)室化;c. SpmX抑制PodJ相分離。
總結(jié)與展望
該工作提出了一種新的微生物細(xì)胞極性構(gòu)建和動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制,該機(jī)制涉及細(xì)菌新細(xì)胞極組裝和新、舊細(xì)胞極重塑(圖5)。論文闡述了天然蛋白通過(guò)相分離形成無(wú)膜區(qū)室的分子基礎(chǔ),解析了細(xì)胞區(qū)室化的生理功能及動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié),證實(shí)了相分離作為組裝微生物細(xì)胞極性樞紐和調(diào)節(jié)不對(duì)稱細(xì)胞分裂的關(guān)鍵作用。通過(guò)對(duì)比原核和真核細(xì)胞,研究團(tuán)隊(duì)預(yù)測(cè)相分離可能作為一種通用的生物物理機(jī)制在細(xì)胞極性發(fā)育過(guò)程起調(diào)控作用。而且,對(duì)相分離及其互作組分進(jìn)行功能解析,有助于進(jìn)一步人工設(shè)計(jì)、合成相關(guān)元件,并為人工無(wú)膜細(xì)胞器和單細(xì)胞生命從頭合成的實(shí)現(xiàn)打下基礎(chǔ)。

圖5. 腳手架蛋白調(diào)控微生物細(xì)胞極性示意圖。a. PodJ結(jié)構(gòu)和功能域示意圖;b. PodJ相分離特征示意圖;c. PodJ和SpmX共同調(diào)節(jié)新月柄桿菌細(xì)胞極組織和形成。
該論文以中科院深圳先進(jìn)院博士后譚為為論文第一作者、博士后程思華和助理研究員李瑩瑩為論文共同第一作者,趙維副研究員為論文通訊作者,深圳先進(jìn)院為論文第一完成單位和第一通訊單位。該研究得到了鐘超教授和婁春波教授的寶貴建議,并獲得了國(guó)家自然科學(xué)基金委、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金委和深圳市合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院的資助。
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課題組介紹:
趙國(guó)屏,博士,研究員,中國(guó)科學(xué)院院士。分子微生物學(xué)家,任中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)首席科學(xué)家,復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)和微生物工程系主任等。
趙維,博士,中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院副研究員。主要研究興趣為微生物細(xì)胞命運(yùn)決定與細(xì)胞合成,近三年來(lái),以通訊作者身份在Nature Communications, Nucleic Acids Research, Mol Cell Proteomics, J Biol Chem等雜志發(fā)表相關(guān)論文多篇,申請(qǐng)及獲批國(guó)家發(fā)明專利多項(xiàng),主持或承擔(dān)科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)自然青年科學(xué)基金、中科院先導(dǎo)專項(xiàng)等科研項(xiàng)目或子課題。
課題組面向開(kāi)發(fā)高通量蛋白篩選和基因編輯技術(shù),致力于揭示分子代謝、極性蛋白定位、無(wú)膜細(xì)胞器組裝、蛋白翻譯后修飾等與微生物染色體分離、細(xì)胞分化的一般規(guī)律關(guān)系,解析其中的分子調(diào)控機(jī)制,指導(dǎo)分子設(shè)計(jì)與細(xì)胞合成等方面的相關(guān)應(yīng)用。現(xiàn)招聘博士后和研究助理多人,不限背景,以有基因組編輯、分子進(jìn)化、相分離等相關(guān)經(jīng)驗(yàn)優(yōu)先,歡迎感興趣的同志投遞簡(jiǎn)歷至郵箱wei.zhao1@siat.ac.cn。
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